BioPlex 2200全自動免疫分析儀檢測血清中抗雙鏈DNA抗體的臨床應(yīng)用*

劉惠源，張 偉，魏雅稚，張允奇，扶忠超，尹志華，葉志中△

(1.深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院風(fēng)濕免疫實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518040；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東深圳 518040)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，本病好發(fā)于育齡期女性，臨床表現(xiàn)多樣，多種自身抗體的出現(xiàn)是SLE的重要特征。其中抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體是公認(rèn)的與SLE病情活動相關(guān)的指標(biāo)，其特異度為95%，靈敏度為70%[1]，抗體效價隨疾病活動度緩解而下降，甚至轉(zhuǎn)陰。抗dsDNA抗體常用于監(jiān)測疾病活動性、藥物治療效果及評價預(yù)后。檢測方法多種，《抗核抗體譜檢測的臨床應(yīng)用專家共識2018年》指出抗dsDNA抗體檢測常用的方法包括使用綠蠅短膜蟲為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的間接免疫熒光法(IIF)、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，若其他方法檢測抗dsDNA抗體陽性與臨床表現(xiàn)不相符時，建議采用IIF或放射免疫法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)[2]。目前，發(fā)達(dá)國家及中國香港早已開始使用BioPlex 2200全自動免疫分析儀檢測自身抗體[3-6]。其檢測原理為流式點(diǎn)陣熒光免疫分析技術(shù)，在國內(nèi)的應(yīng)用還處于初始階段，只有少數(shù)大型醫(yī)院引進(jìn)該實(shí)驗(yàn)檢測技術(shù)檢測自身抗體。其特點(diǎn)是快捷、準(zhǔn)確地為臨床危急、重癥患者提供早期診斷及評估病情活動度的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究同時采用BioPlex 2200與ELISA檢測抗dsDNA抗體，通過與ELISA的比較，旨在為BioPlex 2200的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年3月至2019年1月在深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院住院及門診確診的SLE患者49例(SLE組)，其中男性2例，女性47例，年齡17～50歲，平均(30.63±7.68)歲，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年推薦的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。活動期29例，非活動期20例，疾病活動度判斷根據(jù)2000年修訂的SLE疾病活動指數(shù)。選取同期非SLE患者52例(非SLE組)，包括32例其他結(jié)締組織病患者(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎15例，未分化結(jié)締組織病8例，干燥綜合征6例，混合結(jié)締組織病3例)和20例體檢健康者，男性4例，女性48例，年齡18～52歲，平均(31.38±8.48)歲。均排除合并嚴(yán)重心、肝、腎損害及血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，孕婦、哺乳期婦女、急慢性感染、既往有活動性結(jié)核病史及惡性腫瘤患者。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與研究對象簽訂知情同意書。

1.2儀器與試劑 BioPlex 2200全自動免疫分析儀及配套試劑盒(批號300867)、校準(zhǔn)品(批號50597)、質(zhì)控品(批號50475/50478)均購自美國Bio-Rad公司，該試劑盒可定量檢測dsDNA。技術(shù)原理是采用多通路磁珠同時檢測多種分析物。這些磁珠包被不同種類的熒光染料，每種磁珠包被配基捕獲標(biāo)本中相應(yīng)的檢測物，再通過特殊反應(yīng)進(jìn)行檢測，目標(biāo)物被吸附在磁珠表面形成相應(yīng)免疫復(fù)合物而被檢測，運(yùn)用每種染料激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長差來檢測每種分析物和質(zhì)控磁珠，產(chǎn)生結(jié)合物被用作熒光報告基團(tuán)。系統(tǒng)軟件以內(nèi)標(biāo)珠固有熒光為標(biāo)準(zhǔn)將信號轉(zhuǎn)換成相對熒光強(qiáng)度值，再將其轉(zhuǎn)換為熒光比率。將熒光率與特定校準(zhǔn)曲線來比較，從而得出抗體指數(shù)來表示分析物水平。ELISA檢測采用抗dsDNA抗體檢測試劑盒(購自中國杭州醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司，批號E180108CG)，應(yīng)用酶標(biāo)儀(購自中國匯松公司，型號MB-580)讀取結(jié)果。所有試劑均在有效期內(nèi)使用，并嚴(yán)格按照試劑說明操作。

1.3方法 BioPlex 2200全自動免疫分析儀按照試劑盒操作說明書和儀器BioPlex 2200檢測系統(tǒng)要求進(jìn)行定標(biāo)和質(zhì)控后，再進(jìn)行標(biāo)本檢測。所有研究對象均空腹采集靜脈血3 mL，離心后血清標(biāo)本儲存于-80 ℃冰箱。所有血清標(biāo)本一次性溶解恢復(fù)室溫后上機(jī)檢測，水平≥10 IU/mL定義為陽性，線性范圍為1～300 IU/mL。ELISA檢測按試劑盒操作說明將所有血清標(biāo)本恢復(fù)室溫后進(jìn)行1∶201稀釋，并按照操作說明依次加入1～3號標(biāo)準(zhǔn)品、陰性、陽性對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測值繪制出參數(shù)曲線，計算結(jié)果，水平>100 IU/mL定義為陽性。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法檢測抗dsDNA抗體的性能比較 BioPlex 2200檢測抗dsDNA抗體的靈敏度為57.14%(28/49)，特異度為94.23%(49/52)； ELISA檢測抗dsDNA抗體的靈敏度為53.06%(26/49)，特異度為96.15%(50/52)。BioPlex 2200檢測的陽性預(yù)測值低于ELISA，陰性預(yù)測值高于ELISA。見表1。

表1 兩種方法檢測抗dsDNA抗體的性能比較(%)

2.2兩種方法檢測抗dsDNA抗體的結(jié)果一致性分析 兩種方法共檢測101份血清標(biāo)本。兩種方法檢測均為陽性27例，均為陰性69例，不一致5例，兩種方法總體符合率為95.05%(96/101)。通過χ2檢驗(yàn)評估兩種檢測方法的差異性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=78.69，P=0.375)；通過Kappa值進(jìn)行一致性評價，Kappa=0.880，說明兩種方法一致性較好。見表2。

表2 兩種方法檢測抗dsDNA抗體的結(jié)果一致性評估(n)

2.3BioPlex 2200檢測各組抗dsDNA抗體水平比較 通過單因素方差分析比較各組抗dsDNA抗體水平，BioPlex 2200檢測抗dsDNA抗體，3組(SLE組活動期組、SLE非活動期組、非SLE組)抗dsDNA抗體水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=61.52，P<0.05)。SLE活動期組與SLE非活動期組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SLE活動期組與非SLE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SLE非活動期組與非SLE組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 BioPlex 2200檢測各組抗dsDNA抗體水平的比較

注:與SLE活動期組比較，aP<0.05。

3 討 論

SLE是一種多系統(tǒng)損害的自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡女性。常伴有重要器官的受累，如腎臟、肺部、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及關(guān)節(jié)、皮膚等，危重癥患者常危及生命，早期診斷和及時治療對控制疾病發(fā)展及預(yù)后至關(guān)重要。抗dsDNA抗體自1957年就被公認(rèn)為是SLE的診斷標(biāo)志物[7]。BARNADO等[8]研究表明，與其他自身抗體相比，抗dsDNA抗體在評估患者主要SLE表現(xiàn)的預(yù)后方面可能是最相關(guān)的，研究確定抗dsDNA抗體是SLE主要器官受累的驅(qū)動因素，對主要器官損害的參與程度最大，抗dsDNA抗體水平對SLE臨床表現(xiàn)的影響比自身抗體總體水平更顯著。抗dsDNA抗體的檢測方法多種多樣，國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院檢驗(yàn)科或?qū)嶒?yàn)室采用IIF、ELISA、免疫印跡法檢測抗dsDNA抗體。其中IIF、ELISA手工操作比較繁瑣，一般需要2～3 h才得到結(jié)果，人為干擾因素較多且不可避免。免疫印跡法可減少人力資源及外界干擾因素。YI等[9]研究顯示，線性免疫印跡抗核抗體17項(xiàng)(ANA-17s)檢測結(jié)果與歐盟免疫印跡檢測結(jié)果比較，最常見的抗體幾乎完全一致，然而免疫印跡法只有定性結(jié)果，傳統(tǒng)的檢測方法正在被自動化高通量檢測方法所取代。

近年來，隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，國外已經(jīng)應(yīng)用BioPlex 2200全自動免疫分析檢測技術(shù)檢測臨床標(biāo)本[3-7]。BioPlex 2200運(yùn)用懸浮芯片技術(shù)檢測多項(xiàng)自身抗體，包括抗dsDNA抗體、抗可溶性抗原(ENA)抗體及抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體等。檢測系統(tǒng)完全自動化、智能化、高通量，而且具有很高的分析效率，檢測快速、簡單、便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、特異度高、靈活性好[7,10]。國外對BioPlex 2200的檢測性能方面做了不少對比研究，在檢測抗dsDNA抗體方面，BioPlex 2200檢測的結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA檢測結(jié)果具有可比性，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室對自身免疫性疾病的篩查[4]。此外，對水痘帶狀皰疹病毒、梅毒病毒及人類免疫缺陷病毒急性感染的檢測都有較好的性能[11-13]。BOSE等[14]研究顯示，BioPlex 2200檢測的抗染色質(zhì)抗體對診斷SLE有較高的特異性，但對區(qū)分SLE和混合性結(jié)締組織病或未分化結(jié)締組織病沒有幫助。國內(nèi)除了香港學(xué)者AU等[6]使用BioPlex 2200檢測抗dsDNA抗體的相關(guān)報道外，暫未見其他相關(guān)報道。

本研究是同時運(yùn)用BioPlex 2200和ELISA檢測抗dsDNA抗體，研究結(jié)果顯示，101例研究對象中BioPlex 2200和ELISA有5例檢測抗dsDNA抗體結(jié)果不一致，其中有4例BioPlex 2200陽性，ELISA陰性，有1例BioPlex 2200陰性，ELISA陽性，通過χ2檢驗(yàn)評估兩種檢測方法的差異性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即認(rèn)為兩種檢測方法的檢測效能相同。KIM等[4]研究顯示，ELISA檢測抗dsDNA抗體陽性的79例標(biāo)本中，使用BioPlex 2200檢測有78例(98.7%)血清抗dsDNA抗體陽性，這兩種方法只有1例患者的抗dsDNA抗體檢測結(jié)果存在差異，一致性好。本研究中ELSIA檢測抗dsDNA抗體陽性28例，BioPlex 2200檢測陽性31例，與KIM等[4]結(jié)果不一致，考慮可能與本研究檢測的標(biāo)本量有關(guān)，然而BioPlex 2200通常比其他方法具有更高的靈敏度，但其特異度較低[6]。因此尚需要更大樣本量的多中心研究進(jìn)行進(jìn)一步的評估。

通過Kappa值進(jìn)行一致性評價，Kappa值越大，表明一致性越好，若Kappa≥0.750，表明一致性較好，Kappa<0.400，說明一致程度不夠理想。本研究結(jié)果顯示，Kappa=0.880>0.700，說明兩種方法一致性較好，證明該檢測系統(tǒng)增加了創(chuàng)新性和方便性，而其檢測的效能與傳統(tǒng)方法不相上下，可以更好地為臨床服務(wù)。BioPlex 2200檢測靈敏度為57.14%，特異度為94.23%，ELISA靈敏度為53.06%，特異度為96.15%，與BIRTANE等[15]報道的抗dsDNA抗體檢測在SLE中具有97.4%的特異度和57.3%的靈敏度較相符。ALMEIDA等[16]提出，檢測抗dsDNA抗體最有效的方案是同時結(jié)合兩種定量方法，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。因此臨床中需要首先使用方便、快捷的檢測方法對抗dsDNA抗體進(jìn)行初步檢測，與臨床表現(xiàn)不符時需要用另一種方法再次檢測。比較了BioPlex 2200檢測抗dsDNA抗體在不同組的水平，除SLE非活動期組與非SLE組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外，其余組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明抗dsDNA抗體不僅為SLE的診斷提供重要依據(jù)，對臨床病情活動的判斷亦有重要價值。

BioPlex 2200檢測的整體性能與傳統(tǒng)ELISA技術(shù)相似，但具有檢測速度較高和人力資源消耗較少的優(yōu)點(diǎn)[6]。BioPlex 2200系統(tǒng)具有自動化與智能化的特點(diǎn)，血清直接上機(jī)檢測，45 min即可得到檢測報告，可隨時添加標(biāo)本，支持急診檢測，對急危重癥SLE患者的早期診治具有重大意義。

4 結(jié) 論

綜上所述，BioPlex 2200全自動免疫分析儀檢測抗dsDNA抗體與傳統(tǒng)的ELISA相比，檢驗(yàn)效能具有較高的一致性，而且其簡便、快捷、人工干預(yù)少，值得臨床上推廣應(yīng)用。