基于單壁碳納米管的化學-光熱協同治療去勢抵抗性前列腺癌的研究

宋緒佳，張時君，呂文鑫，黃 林，張 言，吳明貴#，謝少偉#

1.廣西壯族自治區柳州市工人醫院，廣西醫科大學第四附屬醫院泌尿外科，柳州545005；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院超聲醫學科，上海200127

前列腺癌是男性泌尿生殖系統較常見的惡性腫瘤[1-2]，內分泌治療后大部分會轉變為去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），其預后較差。多西他賽（docetaxel，DTX）是CRPC一線化學治療（化療）藥物，然而隨著治療的進行，大部分患者對其產生抗性[3-4]。因此，如何解決CRPC對DTX的耐藥問題引起了廣泛關注[5-6]。快速發展的納米技術為我們提供了一個很好的藥物遞送手段[7-8]，解決了一些疏水藥物難溶解、多種藥物具有不同藥代動力學行為的問題。并且由于納米載體本身的特性，一些新興治療手段也應運而生，如光動力治療、光熱治療及基因治療等[9-13]。光熱治療利用光敏劑的高效光熱轉換效率，實現局部、非入侵式、選擇性殺死被光吸收劑納米顆粒結合并暴露在近紅外光下的靶細胞，并在多種腫瘤模型中表現出了巨大的治療潛力[14-15]。當藥物負載到作為光敏劑的納米載體后，還可實現靶向給藥、精準釋放的目的，從而降低化療藥物在非靶點的系統毒性。然而納米材料由于其粒徑較大（數十納米至數微米），當其通過靜脈給藥后，大多數納米載體可被內皮網狀系統（reticular endothelial system，RES）識別，從而降低了納米材料的靶向效率。而聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾后的納米材料一定程度上可以避免被RES所捕獲，而增加其血液循環時間，進而通過實體瘤組織中血管的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）增加了藥物納米載體的靶向效率。近幾年，大量臨床前研究[16-17]表明，納米載體本身帶來的光熱治療方式往往與常規化療起到協同抑瘤的作用，而使得腫瘤耐藥性得到改善，很大程度上改善患者的預后及治療效果。因此，以納米載體為基礎，探討光熱治療與化療協同的抑瘤機制，增敏化療效果，在臨床上具有重要的意義。本研究以被截短的單壁碳納米管（shorten singlewalled carbon nanotubes，s-SWCNTs）為載體，并將DTX負載到其表面后，探討化療和光熱對CRPC細胞系C4-2的協同殺傷作用及體內抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物

C4-2細胞由上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院干細胞中心提供。Balb/c裸鼠購于上海斯萊克動物實驗中心（Slac Laboratory，中國），生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005，在（20±2） ℃、（60±10） %相對濕度、12 h光照/黑暗循環的標準條件下進行飼養。所有動物實驗均按照實驗動物管理條例規定進行，并經上海交通大學醫學院動物保護與護理委員會批準，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0009。

1.2 材料與試劑

單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）純度＞95%，購于中國科學院成都有機所有限公司；PEG購于Polyvivo公司（美國）；DTX純度＞99%，購于USP公司（美國）；體外培養所需的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、PRMI-1640培養基及青鏈霉素混合液購于Gibco公司（美國）；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；透析袋，截留相對分子質量為3 500，購于上海國藥集團；實驗中所涉及的化學試劑，如乙醇、濃H2SO4、濃HCl等均為分析純，購于上海國藥集團。

1.3 主要儀器

CO2恒溫培養箱（美國Thermo公司），倒置熒光顯微鏡（日本Leica公司），紫外分光光度儀Lambda 950（美國PerkinElmer公司），冷凍離心機（美國Thermo公司），酶標儀SpectraMax M5（中國美谷分子儀器有限公司），紅外熱像儀（美國菲力爾公司），高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），傅里葉變換紅外光譜（瑞士梅特勒-托利多公司），Zeta電位儀（英國馬爾文公司），自動電導滴定儀（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的制備與表征

1.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外釋藥行為

上述制備的DTX@s-SWCNTs/PEG（1 mg SWCNTs，1.23 mg DTX）重新溶解在pH值為6.5的0.5 mL磷酸緩沖溶液（PBS）中（含10%吐溫），轉移至透析袋后（截留相對分子質量3 500），并將其放入20 mL相同pH值的PBS中，以37 ℃、300 r/min的條件孵育48 h。在預定的時間點，收集200 μL溶液，并使用高效液相色譜法測定釋放到樣品中的DTX含量。為測定藥物累積釋放曲線，在每個采樣點都用相同體積新鮮PBS（200 μL）替換樣品。所有實驗點采取3次平行試驗進行數據統計及分析。

1.6 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外光熱行為

將制備的DTX@s-SWCNTs/PEG配制為一系列濃度的水溶液（0～100 μg/mL），在1 W/cm2功率密度的808 nm激光照射下，通過紅外熱像儀來檢測溶液溫度的變化。為監測納米系統的光熱穩定性，將30 μg/mL的DTX@s-SWCNTs/PEG溶液置于功率密度為2 W/cm2的激光下輻射3 min后，關閉激光，室溫恢復5 min，循環3次以觀察溶液溫度變化趨勢，并繪制出溫度-時間函數關系曲線。

1.7 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外毒性研究

將C4-2細胞培養于96孔板中，每孔細胞為2×103個，培養24 h后，進行如下操作：①為了檢測納米系統的生物安全性，將含不同濃度的s-SWCNTs/PEG的完全培養液（0～100 μg/mL）加入到培養的細胞中，再孵育24 h后，用PBS清洗3次，再加入含CCK-8檢測液的新鮮培養液后在37 ℃培養箱培養1～3 h，隨后用酶標儀檢測細胞的吸光度值，與未添加材料細胞的吸光度值進行比較，來確定細胞的活性。②為了檢測光熱特性對細胞的潛在毒性，經過上述相同的操作后，用1 W/cm2功率密度的激光每孔照射5 min，更換新鮮培養基，再孵育24 h后進行CCK-8檢測，來確定細胞的活力。③為了評估化療藥物DTX及DTX協同光熱對C4-2的毒性，將負載DTX的DTX@s-SWCNTs/PEG以上述相同的濃度及培養條件進行實驗，不經過光照和經過光照處理（1 W/cm2每孔照射5 min），再孵育24 h后，進行細胞活性評價。繪制細胞活性與材料濃度相關曲線。

1.8 DTX@s-SWCNTs/PEG的體內抑瘤效果評估

2 結果

2.1 DTX@s-SWCNTs/PEG的表征

原始SWCNTs表面電位呈電中性，而經過混酸60℃處理6 h后，電位急劇下降到（-31.3±0.9） mV（圖1A），通過自動滴定儀測試結果得到每克SWCNTs所含-COOH的量為0.412 mol（圖1B）。傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared，FTIR）譜圖中，約1 800 cm-1處 的C=O伸縮振動峰表明-COOH成功引入（圖1C）。而此時SWCNTs的長度由原來的5～30 μm截短為1～3 μm（s-SWCNTs）。為進一步改善s-SWCNTs在體內的生物相容性，氨基封端的PEG（相對分子質量30 000）通過酰胺鍵與s-SWCNTs表面引入的-COOH進行反應，而使得PEG成功地負載到s-SWCNTs的表面（s-SWCNTs/PEG），此時，Zeta電位上升至（-17.3±0.8） mV（圖1A）。最后通過納米沉淀法使DTX的芳香結構與s-SWCNTs的疏水表面形成π-π堆積而將化療藥物DTX負載到s-SWCNTs上[18]。通過紫外-可見光吸收光譜可見，s-SWCNTs在約250 nm處形成新峰，表明DTX被成功地負載（圖1D）。最終DTX@s-SWCNTs/PEG表面電位為（-10.3±1.5） mV，且在水溶液及生理環境中表現出很好的穩定性。

圖1 DTX@s-SWCNTs/PEG的制備及表征Fig 1 Preparation and characterization of DTX@s-SWCNTs/PEG

2.2 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外載藥與釋藥行為

體外載藥實驗結果表明，隨著DTX的喂料比增加，DTX在s-SWCNTs上的負載量也逐漸增加（圖2A）。最終，每毫克s-SWCNTs可負載1.35 mg DTX。考慮到藥物大量負載會增高納米系統的電位，而使得在生理環境中變得不穩定，因此，本實驗采用1 mg SWCNTs負載1.23 mg DTX的納米系統為最終研究對象。通過高效液相色譜檢測DTX@s-SWCNTs/PEG在pH 6.5的PBS中的釋藥行為來模擬納米系統在腫瘤酸性條件下的藥物釋放行為（圖2B）。實驗結果表明，納米系統在12 h內快速釋放，并且在24 h內藥物釋放可高達（56.4±3.2） %，這種酸性釋藥行為也有利于DTX@s-SWCNTs/PEG在體內對腫瘤的抑制。

圖2 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外載藥（A）與釋藥（B）Fig 2 Drug loading (A) and release (B) profiles of DTX form DTX@s-SWCNTs/PEG

2.3 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外光熱性能評估

由于SWCNTs在近紅外Ⅰ區域表現出強的吸收（圖1D），而賦予材料強的光熱性能，從而可使材料作為理想的光熱治療劑。因此，我們在體外首先評價了s-SWCNTs/PEG納米系統在808 nm激光輻射下的熱性能。當激光以2 W/cm2的功率密度輻射30 μg/mL的納米系統時，紅外熱像儀表明s-SWCNTs/PEG水溶液被快速地加熱（圖3A）。僅輻射3 min就可使體系最高溫升至（52.6±0.8） ℃；輻射10 min后，體系溫度高達（60.7±1.6） ℃。進一步探討體系溫度與輻射時間關系的實驗表明，在1 W/cm2的激光功率密度下，隨著納米載體系統濃度的增加（10～100 μg/mL），其溫度也逐漸升高（圖3B）。最后，材料的光熱穩定性能結果表明，高濃度的納米載體（30 μg/mL）在高光照功率密度（2 W/cm2）循環照射下，材料熱性能并未發生變化。每次光照循環下，材料都能達到最大的溫度，且關閉激光后，系統也能在一定時間內恢復至室溫（圖3C）。

圖3 DTX@s-SWCNTs/PEG體外光熱性能表征Fig 3 Photothermal performance of DTX@s-SWCNTs/PEG in vitro

2.4 DTX@s-SWCNTs/PEG的體外細胞毒性評價

CCK-8實驗結果表明，光熱、化療對C4-2細胞表現出協同殺傷作用（圖4）。而不同濃度的材料與C4-2共培養24 h的結果表明，材料沒有表現出明顯的細胞毒性（圖4A）[19]。受到激光輻射后（1 W/cm2，5 min），材料展現出明顯的細胞毒性，且隨著濃度進一步增加，細胞活性逐漸降低。化療藥物毒性監測實驗表明，負載到s-SWCNTs的DTX的毒性高于游離的DTX藥物（圖4B），進一步進行光照處理，其細胞活性進一步下降。即使在較低的材料濃度下（5 μg/mL），聯合治療也表現出較高的細胞毒性，此時細胞存活率只有（43.2±5.7） %。這些實驗結果表明負載DTX的s-SWCNTs納米系統表現出協同的化療-光熱殺傷作用，可進一步用于負瘤小鼠的光熱-化療協同治療。

圖4 DTX@s-SWCNTs/PEG對C4-2細胞的協同化療-光熱體外毒性表征Fig 4 Synergetic chemo-photothermal combination therapy with DTX@s-SWCNTs/PEG in C4-2 cells

2.5 DTX@s-SWCNTs/PEG的體內協同抑瘤作用

評估材料體外協同抑制C4-2細胞的生長后，進一步評估了其體內協同抗瘤效果。s-SWCNTs/PEG納米復合物靜脈注射荷瘤小鼠24 h后，進行光照處理。紅外熱像儀數據表明，當小鼠腫瘤暴露于2 W/cm2的光照功率密度下，腫瘤部位溫度迅速上升，僅照射5 min，腫瘤溫度高達65.7 ℃（圖5A）。為避免對正常組織造成損傷，實驗中選擇適度的光照功率密度（1 W/cm2）對腫瘤部位光照5 min，作為腫瘤的最佳光照條件。此時，腫瘤溫度保持在約50 ℃。多種處理方式治療后，對小鼠腫瘤體積監測表明（圖5B），化療對腫瘤有輕微的抑制作用，光照組雖然能較快地消融原發瘤，但在治療2周后腫瘤復發；而聯合組對腫瘤的抑制效果最明顯，且在3周的實驗觀察期沒有發現腫瘤復發。小鼠的體質量實驗監測結果表明，s-SWCNTs/PEG和DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統在體內并沒有表現出明顯的毒性（圖5C）。綜合上述結果表明，負載DTX的s-SWCNTs納米系統在體內表現出協同的抑制前列腺癌的作用，可避免單一治療的不足及化療藥物產生的抗藥性。

圖5 體內化療-光照協同抑瘤作用評價Fig 5 Synergetic therapeutic effect of chemo-photothermal therapy

3 討論

CRPC在臨床上往往以化療藥物（如DTX）為主，而單一化療往往效果不理想，且長時間、大劑量用藥后，腫瘤表現出抗性。而光熱治療可選擇性地對腫瘤進行殺傷，大量臨床前實驗結果[14-18,20]表明，熱處理可在一定程度上增敏化療效果，所以將光熱和化療藥物聯合，在臨床上具有巨大潛力。由于SWCNTs自身獨特的性能，可以將2種治療方式有機地結合起來。一方面，SWCNTs的高比表面積及疏水表面使其在載藥方面表現出優異的特性[20-22]；另一方面，自身高效的光熱轉換效率也使其成為理想的光熱治療劑[17,23-24]。因此本研究以SWCNTs為藥物載體，在體內、外評價了光熱-化療協同抑制CRPC的潛力。

原始SWCNTs的長度限制了其在生物體內的應用，經過截短后，其尺寸有利于體內通過EPR效應在腫瘤內部富集。PEG修飾可避免其被RES吞噬，而增加其血液循環時間[25-26]。酸響應釋放藥物的行為，一定程度上降低化療藥物對正常器官的毒性；與游離DTX相比，這種靶向遞送、精準釋放使得DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統表現出體內應用優勢。對C4-2荷瘤小鼠治療結果同樣表明了光熱-化療協同作用的優勢，DTX@s-SWCNTs/PEG納米系統不僅能快速地消融腫瘤，還避免了腫瘤的復發。并且這種基于s-SWCNTs的化療-熱療聯合模式治療，在本研究中的劑量下（靜脈注射10 mg/kg），表現出高的生物相容性。

總之，由于SWCNTs獨特的物理結構及高效的光熱轉化性能，不僅使其可作為理想的藥物載體，還可作為強有力的光熱治療劑。當DTX以1.23:1（質量比）的比例負載到PEG修飾的s-SWCNTs后，納米系統同時擁有化療及光熱治療特性。體外釋藥行為表明，DTX可在酸性環境中快速地從納米載體上釋放出來，這有利于腫瘤酸性環境中的釋藥行為。納米系統在體外對C4-2細胞表現出化療-光熱協同的殺傷作用，并且在體內成功消融C4-2移植瘤模型小鼠的腫瘤，避免單一療法帶來的不足，且成功阻止了腫瘤的復發。綜上，本實驗結果表明，基于SWCNTs的化療-光熱協同治療系統具有抑制前列腺癌的巨大潛力，可顯著增敏化療藥物療效，為前列腺癌的治療提供了新方向。