基于近紅外二區熒光納米探針的活體光學成像技術在生物醫學應用的研究進展

陳 驀，陳 俊，陳世益

復旦大學附屬華山醫院運動醫學科，上海200040

光學成像技術具有靈敏度高、非侵入性和實時成像等優點，符合當下生物醫學領域對于非侵入成像診斷技術的要求，被越來越多地應用于腫瘤組織、血管結構以及其他組織或部位的成像。隨著臨床醫學和生物研究對成像精度和質量要求的不斷提高，在傳統的可見光成像的基礎上，近紅外（near-infrared，NIR）成像技術也日益受到基礎科研工作者和臨床醫師的關注。NIR波段介于可見光和中紅外之間，波長在650～2 500 nm[1-4]，而根據波長被細分為不同的光學窗口。例如，研究較早、較為經典的NIR光學成像窗口NIR一區[4]（first near-infrared，NIR-Ⅰ）在650～950 nm波長范圍內，近年來光學活體成像領域研究中令人矚目的NIR二區[5]（second near-infrared，NIR-Ⅱ）在波長1 000～1 700 nm范圍內。NIR活體成像具有眾多優點：與臨床常用的X射線、核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）和超聲等成像方法相比，NIR等光學成像的最大優點是空間分辨率高[6]；與可見光成像方法相比，NIR活體成像具有自體生物熒光背景低，生物體內血液和組織對光吸收少、散射少，組織穿透度深，成像速度快，圖像對比度（或靈敏度）高，不良反應小以及對水、脂類、膠原蛋白的區分比較敏感等諸多優點[2,7-8]。而由于具有更長的波長，且光的散射強度隨波長的增長成指數下降，使得NIR-Ⅱ與經典的NIR-Ⅰ活體成像相比，光子散射和吸收更少，自體生物熒光背景更低，具有更深的穿透性、更高的時空分辨率和信噪比[9]。NIR-Ⅱ又可劃分為NIR-Ⅱ a（1 000～1 400 nm）和NIR-Ⅱ b（1 500～1 700 nm）[10]。目前NIR-Ⅱ的研究大多集中在NIR-Ⅱ a，而已知的NIR-Ⅱ b熒光納米探針尚不多，因此本文主要探討波長位于NIR-Ⅱ a的熒光納米探針。

雖然NIR-Ⅱ活體成像具有諸多優勢，但目前其應用仍受限于熒光納米探針的發展跟不上成像設備和成像技術的發展需求。NIR-Ⅱ所用的熒光納米探針與NIR-Ⅰ常用的熒光染料（如美國食品藥品監督管理局批準的吲哚菁綠和亞甲藍）有所不同，只有少數材料可以發射NIR-Ⅱ的波長。這些材料中一大部分是納米材料，因其具有納米級（0.1～100 nm）尺寸，使其在光學、熱學、電學、磁學以及化學方面的性質與非納米材料存在顯著差別，并在NIR-Ⅱ成像方面具有一定優勢。NIR-Ⅱ熒光納米探針根據制備材料可分為無機熒光納米探針和有機熒光納米探針，前者主要包括量子點（quantum dot，QD）、稀土納米粒子（rare earth nanoparticle，RENP）、單壁碳納米管（single-wallcarbon nanotube，SWCNT），后者以共軛聚合物為主[5]。本文就這些熒光納米探針的優點及局限性介紹其在NIR-Ⅱ活體成像應用中的相關進展，并對其未來的發展進行展望。

1 QD

QD作為一種半導體熒光納米探針，具有良好的光學和化學穩定性，發射波長窄且可調諧，雙光子吸收截面較高，具多色性等熒光成像特點，而其能夠交聯分子的特點更使其具有可以載藥或攜帶其他靶向分子的潛質。QD最早于20世紀70年代被成功制備。Bruchez等[11]將QD作為熒光納米探針應用于生物染色和診斷，實現了將其作為特異性生物標記的目標，為QD在生物醫學領域的研究樹立了里程碑。

第1代QD主要以鎘化物[硫化鎘（CdS）和硒化鎘（CdSe） ]、鉛化物[硫化鉛（PbS）和硒化鉛（PbSe） ]為主，制備方法成熟，產量高。由于鉛和鎘作為重金屬具有已經明確的生物毒性，第1代QD在活體成像方面的應用受到限制。第2代QD為解決這一問題主要采用了2種改進方式。

第1種是在第1代QD表面包被其他物質外殼。Kong等[12]利用微波加熱法合成了一種核糖核酸酶包被的PbS QD（RNase-A@PbS QD）。與之前報道的紅外染料IR26的量子產率（0.11%）[13]相比，RNase-A@PbS QD的量子產率（17.3%）證實其是可用于活體成像方面最亮的水溶性NIR-Ⅱ發射體之一。更重要的是，體外實驗表明這種RNase-A@PbS QD對胎鼠大腦皮質神經元細胞、人胃上皮正常細胞GES-1和人惡性黑色素瘤細胞A375均無毒性，還可通過網狀內皮系統將體內靜脈注射的QD在幾日內完全代謝，從而將體內可能釋放的鉛的潛在長期毒性降到最低。

第2種是更換低毒性材料制備QD，如毒性較低的硫化銀（Ag2S）QD[14]、磷化銦-硫化鋅（InP/ZnS）QD[15]、銅銦硫-硫化鋅（CuInS/ZnS）QD[16]、銀銦硒-硒化鋅（AgInSe2-ZnSe）QD[17]等。Allocca等[18]為對比InP QD和CdSe QD的毒性，利用水螅進行生物體內實驗。實驗發現InP QD的毒性較CdSe QD低，且這種毒性在體內可逆，類似于相同劑量的無毒納米材料（如碳納米管和二氧化硅納米粒子）在水螅中測試的報道結果。雖然在動物模型中改良后的QD與含鎘QD比較似乎相對安全，但并不能因此完全打消該QD對人體是否具有毒性的疑慮。Chen等[15]采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察InP/ZnS QD標記的人肺癌細胞HCC-15和肺泡Ⅱ型上皮細胞RLE-6TN，發現InP/ZnS QD可進入細胞，且促進細胞凋亡與細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。因此，InP/ZnS QD仍存在一定生物毒性，未來如應用于活體成像或治療給藥還需優化表面修飾，進一步降低其生物毒性。

雖然目前的制備方法和表面功能修飾方式已降低了這些NIR-Ⅱ QD的生物毒性，但其安全性還存在爭議，這可能會成為其應用于臨床的潛在危險因素。

2 RENP

稀土是化學周期表中鈧、釔和鑭系元素共17種金屬元素的總稱。摻雜稀土元素的納米粒子具有獨特的光學、電學、磁學特性。鑭系元素具有低光子吸收的特性[7]，以鑭系化合物為代表的RENP的階梯狀能級具有窄的發射寬度，使得多光譜成像具有最小的光譜重疊。除此之外，RENP還具有尺寸高度可控、無光漂白現象、保存時間長、生物相容性好、發射波長較長等優點[19-20]。

RENP已應用于小腫瘤、血管以及骨的NIR-Ⅱ成像研究。Li等[21]用聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）對以四氟镥鈉作基質、釓作敏化劑、釹作激活劑的棒狀納米粒子（NaLuF:Gd/Nd納米棒）進行改性，以便用于高靈敏度的活體成像和光學成像引導下的小腫瘤檢測；以釓作為主要合成元素，通過摻雜釹元素進行調整，以便將發射波長集中在1 056～1 328 nm，獲得較高的光穩定性；動物實驗證實了其在NIR-Ⅱ對小腫瘤（5 mm）診斷的可行性和對小血管成像具有高空間分辨率（約105 μm）；組織學實驗表明，這種納米棒具有親水性和良好的生物相容性，對活體動物的毒性作用微乎其微。

與大多數熒光納米探針應用于血管成像不同，He等[22]制備了一種由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇包被并摻有稀土的納米粒子 （RENPs@DSPE-mPEG），該納米粒子因在不連接任何靶向配體的情況下對骨骼固有親和力，而有望成為骨骼系統成像的熒光納米探針；除骨顯像之外，RENPs@DSPE-mPEG也可在血管和淋巴結中顯像；有趣的是，與大多數納米材料在生物體內通過肝臟等器官代謝不同，RENPs@DSPE-mPEG可以通過循環白細胞內化。這一發現為RENP在腫瘤的免疫治療等領域的應用提供了可能。

3 SWCNT

SWCNT由單層石墨烯卷曲而成，直徑在1～150 nm，長度可達厘米級。自1991年日本電鏡學家Iijima[23]在Nature雜志上首次發表了在用直流電弧放電法制備 C60的過程中發現碳納米管的報道之后，碳納米管便迅速在物理、化學和工業等諸多領域廣泛研究應用。直到2002年，O′Connell等[24]發現SWCNT能 在NIR波段發射熒光并在Science雜志上發表該研究成果，SWCNT在NIR光學成像方面的應用才為大家所知曉。SWCNT是一種近似理想的生物探針，在NIR-Ⅱ具有很強的熒光，幾乎不具有任何毒性，且幾乎無光漂白現象。

Takeuchi等[25]制備了一種涂有磷脂-聚乙二醇并摻雜氧元素的SWCNT（o-SWCNT-PEG），這種SWCNT通過980 nm激發光在約1 300 nm處發出熒光；通過靜脈注射的o-SWCNT-PEG可在小鼠血管內循環3 h，在1 d內清除；小鼠肝臟和脾臟的SWCNT熒光信號持續了1個月，2個月后小鼠未見明顯體質量或外觀異常，提示o-SWCNT-PEG的毒性較低。因此，o-SWCNT-PEG具有在NIR-Ⅱ波長范圍內成為血管成像探針的潛質。

雖然SWCNT被認為是NIR-Ⅱ成像的理想候選材料，但其水溶性和生物相容性較差。現可通過共價或非共價表面修飾的方法來解決這一問題。共價修飾會打破共軛π鍵連接，降低熒光產量和活體成像的清晰度。相比之下，非共價表面修飾可以保留由sp2石墨化碳原子組成的初始結構，并保持預期的NIR-Ⅱ波段的熒光發射[20]。因此，非共價表面修飾可作為表面修飾的首選方法。值得注意的是，SWCNT的低熒光量子產量一直是其發展的一個瓶頸，有文獻[26]顯示，SWCNT的熒光量子產率僅約為0.4%。

4 共軛聚合物

共軛聚合物是由3個及以上互相平行的p軌道形成大π鍵的共軛化合物聚合而成的。共軛聚合物具有高摩爾消光系數、寬發射波長、較強的光捕獲能力，可放大熒光傳感信號，并且易于制備。但它受激發波長和發射波長的限制[26]，且大部分共軛聚合物的水溶性較差。

具有供體-受體結構的低能隙共軛聚合物已作為NIR熒光納米探針應用于活體成像。Zhang等[27]為控制分子內電荷轉移（intramolecular charge transfer，ICT）以保持低能帶隙，提高NIR-Ⅱ熒光強度，開發了一種水溶性醌型聚合物。這種聚合物通過增加噻吩鏈長度，降低吸電子基團的密度，使ICT減少，NIR-Ⅱ熒光變強。該醌型聚合物探針可用于體內細胞示蹤、血管系統成像、淋巴引流成像等多種生物醫學成像，且具有良好的長期穩定性和較高的體內空間分辨率。

值得一提的是，共軛聚合物在光聲成像方面具有良好的前景。雖然QD、SWCNT等熒光納米探針也在光聲成像的研究中有所應用，但共軛聚合物在光聲成像方面的研究應用相比前兩者更多。共軛聚合物能利用光聲效應將吸收的光子經熱彈性膨脹轉化為聲波[28]，從而結合光學和聲學成像各自的優勢，減少光散射和組織吸收，增強成像分辨率。共軛聚合物尤其對深部組織的成像具有優勢，可實現更加清晰、直觀、立體的成像目標。

Jiang等[29]報道了一個可用于NIR-Ⅱ光聲成像的共軛聚合物納米粒子，其可作為光聲發射器，在1 064 nm處發出高強度的光聲信號，透過小鼠的完整顱骨對皮下腫瘤和深部腦血管系統進行清晰的NIR-Ⅱ光聲成像。這種共軛聚合物納米粒子能被吞噬細胞中的髓過氧化物酶和脂肪酶降解，由非熒光納米粒子（30 nm）轉化為NIR熒光超細代謝物（約1 nm）。更重要的是，小鼠實驗表明其能被肝臟和腎臟完全代謝清除，無毒性。該類報道增加了對于共軛聚合物光聲成像未來早日應用于臨床的信心。

5 展望

綜上所述，上述NIR-Ⅱ活體成像常用熒光納米探針均有各自的優缺點，因而針對不同的生物醫學需要，需要選擇更加符合客觀要求的NIR-Ⅱ熒光納米探針。相比較而言，目前用于NIR-Ⅱ活體成像研究的熒光納米探針主要集中在QD，尤其是硫化鉛或者硫化銀QD。因為大量文獻報道通過表面修飾和/或更換低毒性元素等方法能使QD的潛在生物毒性有所降低，所以可以相信NIR-Ⅱ熒光QD在今后的NIR-Ⅱ活體成像領域仍會處于主體地位。RENP的研究緊隨其后，也會在接下來的研究領域占有一席之地。SWCNT在NIR成像領域的應用起步較晚，目前研究也較少，且受到低生物相容性和低熒光量子產率的限制；若不能解決這些問題，其今后的臨床應用仍困難重重。共軛聚合物因在光聲成像方面具有的優良特性，近年來逐漸受到關注，可能在今后的 NIR-Ⅱ活體多模態成像領域有更廣闊的前景。隨著這些NIR-Ⅱ熒光納米探針的不斷發展，NIR-Ⅱ活體成像技術（包括造影劑和活體成像儀器平臺）也將逐步突破目前的瓶頸，為后續臨床應用奠定良好基礎，并有可能成為臨床影像診斷中的一種重要技術手段。