陰道微生物芯片技術在陰道分泌物念珠菌檢測中的應用

陳雷鳴，陳藝升，李 翠

（復旦大學附屬婦產科醫院檢驗科，上海 200011）

陰道炎是臨床常見婦科炎癥，主要分為細菌性陰道炎、真菌（念珠菌）性陰道炎和滴蟲（陰道毛滴蟲）性陰道炎。有研究結果表明，由念珠菌感染引起的念珠菌性陰道炎占女性陰道炎的20%～45%[1-2]。有75%的成年女性一生中至少會經歷1次真菌性陰道炎，其中有40%～50%還會再次感染，約有5%會因復發而發展為頑固性真菌感染[3]。因此，及時、準確的診斷對有效治療念珠菌性陰道炎具有重要意義。

念珠菌性陰道炎的診斷以臨床癥狀和體征為基礎，并經陰道分泌物病原學檢查確診。目前，臨床主要通過陰道分泌物顯微鏡鏡檢和真菌（念珠菌）顯色培養2種方法常規檢查念珠菌。顯微鏡鏡檢法成本低、操作簡單，但易受檢驗者經驗和涂片制作質量的影響，且敏感性較低，容易因假陰性而漏診。真菌培養法敏感性和特異性較高，可對念珠菌進行定性及定量檢測，但成本高、操作復雜、培養時間長，常需要5 d才能出具完整報告。為了滿足實際需求，臨床亟待快速、簡便、準確性高的檢測方法用于念珠菌性陰道炎的診斷。陰道微生物芯片檢測技術以核酸雜交原理為基礎，可捕獲念珠菌屬獨特的基因序列，具有敏感性高、特異性好、操作簡便等優點。本研究擬比較陰道分泌物涂片鏡檢、念珠菌顯色培養和陰道微生物芯片檢測3種方法診斷念珠菌感染的效能，以探索快速、簡便、準確性高的檢測方法，為提高念珠菌性陰道炎的實驗室檢測水平提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2017年12月—2018年7月于復旦大學附屬婦產科醫院門診就診的疑似陰道炎患者233例，采用無菌拭子采集患者陰道分泌物，采集后立即送檢。

1.2 儀器與試劑

自配10% KOH溶液，酵母菌顯色培養基購自梅里埃（上海）生物制品有限公司，陰道微生物檢測試劑盒（BD Affirm VP Ⅲ）及微探針自動處理儀購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 常規鏡檢法 陰道分泌物用生理鹽水涂片，顯微鏡下進行常規鏡檢，滴加1滴10%KOH溶液混合后鏡檢，以提高陽性率，發現卵圓形真菌孢子、芽生孢子及假菌絲，判讀為陽性；無孢子或假菌絲，則判讀為陰性[4-5]。

1.3.2 真菌顯色培養法 將陰道分泌物接種于酵母菌顯色培養基上，35℃培養24～48 h，根據培養基上有無真菌生長判定結果[5]。

1.3.3 陰道微生物芯片法 按照BD Affirm VPⅢ檢測試劑盒使用說明書進行操作和結果判讀。將裂解液加入采樣管，80℃加熱裂解樣本10 min，加入緩沖液混合震蕩，將過濾后的液體加入試劑板盒，再加入顯色液，插入試劑板，放入微探針自動處理儀運行程序，程序結束后根據陰陽性對照判讀結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計數資料采用x2檢驗和Kappa一致性檢驗。Kappa值≥0.75，說明一致性較好；Kappa值＜0.40，說明一致性不理想；Kappa值為0.40～0.74，說明一致性在可接受范圍內。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積評價3種方法診斷念珠菌感染的效能。

2 結果

2.1 3種方法檢測結果比較

以顯色培養結果為標準，對鏡檢法和陰道微生物芯片法的檢測結果進行比較，Kappa值分別為0.415和0.821，陰道微生物芯片法與顯色培養法具有較高的一致性；與顯色培養法比較，鏡檢法陽性率較低（P＜0.001）。見表1。

表1 3種方法檢測結果比較 例

2.2 ROC曲線分析

鏡檢法、陰道微生物芯片法診斷念珠菌感染的ROC曲線下面積分別為0.73、0.92，陰道微生物芯片法臨床應用價值更高。見圖1。

圖1 陰道微生物芯片法和鏡檢法診斷念珠菌感染的ROC曲線

3 討論

由真菌引起的陰道炎被稱為念珠菌性陰道炎或真菌性陰道炎，是陰道感染的第二大病因[6]。及時、準確的實驗室診斷對臨床及時進行抗真菌治療有重要意義。

顯微鏡鏡檢是常規檢測念珠菌最直觀的方法，10 min即可出具報告，操作簡單、成本低。近年來，隨著抗真菌藥物的過度使用，耐藥菌株不斷增多，鏡下觀察孢子結構常不典型，鑒別診斷比較困難，易造成漏檢，對檢驗人員的經驗要求較高。而熱帶念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等不生長菌絲的念珠菌，鏡檢漏檢率更高[7]，大大延誤了臨床診斷與治療。真菌顯色培養法是檢測念珠菌的金標準，可以進行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗，并可指導臨床用藥，避免耐藥菌株的出現，尤其針對頑固性、復發性念珠菌感染更為有效，但檢測時間較長，一般需要4～5 d才能出具完整報告，不利于疾病的早期診斷和治療。而且，真菌顯色培養法檢驗操作流程較繁瑣，成本較鏡檢法高，且需要檢驗人員具有相應的微生物檢驗專業技能。

陰道微生物芯片技術是以核酸雜交原理為基礎，采用與念珠菌獨特的基因序列互補的2個不同的捕獲探針和顯色探針，通過顯色反應判讀結果，成本較鏡檢法和培養法高，但1 h即可出具報告，操作簡便、敏感性高、特異性好，且對檢驗人員專業要求不高，可操作性強。

本研究結果顯示，鏡檢法假陰性率為53.9%，敏感性為46.1%，與顯色培養法結果的符合率為68.9%；陰道微生態芯片法檢測念珠菌的假陰性率為16.4%，敏感性和特異性分別為83.6%和100.0%，與顯色培養法結果的符合率為90.7%，結果一致性較高。CARTWRIGHT等[7]報道陰道微生物檢測試劑盒檢出念珠菌屬的敏感性、特異性和準確性分別可達到82.3%、98.4%和95.2%，與本研究結果基本一致。ROC曲線分析結果顯示，陰道微生物芯片法診斷念珠菌感染的曲線下面積為0.92，具有較高的診斷價值，而鏡檢法診斷念珠菌感染的曲線下面積僅為0.73。

念珠菌為條件致病菌，一般情況下無臨床癥狀不需要治療，但其繁殖到一定數量時，可引發真菌性陰道炎。無癥狀患者陰道分泌物念珠菌濃度＜1×103CFU/mL，有癥狀患者濃度≥1×104CFU/mL[8]，但念珠菌培養均為陽性。陰道微生物芯片檢測試劑盒對于念珠菌的分析靈敏度在每次檢測的對數期內為1×104CFU/mL[9]，因此陰道微生物芯片檢測技術可以避免因培養陽性而造成的念珠菌性陰道炎臨床診斷的假陽性結果。本研究中顯色培養陽性而陰道微生物芯片法結果為陰性的21例樣本，即是上述原因造成。

鏡檢法雖然操作簡單、方便快捷，但是由于陰道分泌物樣本中各種細胞易造成干擾，且受檢驗人員專業素質、環境等因素影響較大，易造成漏檢和誤檢，比較適合大規模篩查。真菌培養法陽性率和準確度高，但其缺點是操作繁瑣、耗時長。陰道微生物芯片技術通過檢測特異性基因序列，檢測時長僅為1 h，極大地提高了檢測效率，突破了傳統檢測方法的局限性。同時，陰道微生物芯片法還可以同時檢測陰道毛滴蟲和陰道加德納菌，有助于3種常見真菌性陰道炎的臨床診斷。

目前，傳統檢測技術已經無法滿足臨床需要，陰道微生物芯片技術有助于念珠菌性陰道炎的早期診斷，具有較高的實用價值。