ICC 患者血漿ctDNA 突變檢測數字PCR 平臺的建立及臨床應用價值

戴 謙，黃 斐，王宇鵬，黃 傲，成劍文，潘柏申，郭 瑋，周 儉，樊 嘉，楊欣榮，王蓓麗

（1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫院肝外科，上海 200032）

肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）約占原發性肝臟腫瘤的10%～15%，惡性程度高，5年生存率不到10%[1-2]。雖然手術切除是目前ICC首選的治療方式，但由于缺乏有效的早期診斷方法，有近70%的患者并沒有機會接受手術治療，只能采取放療和化療等姑息療法，導致中位生存時間僅為1.8個月，而手術切除的中位生存時間為12.2個月[3]。目前，臨床常用的影像學檢查尚不能準確鑒別ICC與原發性硬化性膽管炎、肝內膽管結石等疾病。而血清學指標如糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等的敏感性、特異性均難以滿足臨床需求[2]。因此尋找更有效的ICC早期預警、復發監測、預后評估及療效監測方法是實現ICC患者早診、早治、改善預后的關鍵[4-5]。

目前多采用腫瘤組織進行基因檢測。然而，對于ICC來說，不僅腫瘤組織取材困難，且瘤內異質性高，不同位點僅有46.8%的突變基因一致率[6]，一些常見突變基因如BRAF、KRAS、EGFR等在腫瘤組織中的檢出率均不足30%[7-8]，且不同ICC患者的高頻突變基因譜也不盡相同[9]。由此可見，單一、特定的突變標志物在ICC診療中的作用有限，所以篩選我國ICC相關的突變基因并建立多個相關基因的診療譜具有重要意義。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）以其半衰期短、無創、可反映腫瘤原發灶整體突變負荷等優勢為這些問題的解決帶來了希望。由于ctDNA僅占血漿循環DNA總量的1%，目前臨床常用的檢測技術無法對其準確定量。數字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）是通過單分子擴增實現核酸拷貝數絕對定量的第3代PCR技術，具有極高的敏感性和特異性，是目前ctDNA突變定量檢測的優選方案。本團隊前期研究已對ICC患者的腫瘤、癌旁組織及外周血進行了全外顯子測序，并參考其他基于ICC組織的大規模測序文獻[7，10-11]，篩選出3個在外周血及腫瘤組織中特異存在的高頻突變基因（KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C）。本研究旨在建立檢測上述3種突變的dPCR平臺，并初步評估該平臺的基本檢測性能及臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年12月在復旦大學附屬中山醫院行切除手術的ICC患者22例，其中男17例、女5例，年齡52～78歲。ICC診斷標準：CA19-9升高或具有影像學特征，且由病理科明確診斷為ICC。ICC患者腫瘤組織樣本來自手術切除組織，用福爾馬林固定后制成石蠟包埋組織切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并由病理科評估，以保證有足夠的腫瘤細胞用于后續檢測。選取2019年7—8月在復旦大學附屬中山醫院行切除手術的肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者10例作為疾病對照，其中男8例、女2例，年齡38～66歲。HCC診斷標準參考《原發性肝癌診療規范（2011年版）》中的診斷標準，所有患者均經病理診斷確診為HCC。選取2018年1—12月復旦大學附屬中山醫院體檢健康者10名作為正常對照，其中男7名、女3名，年齡42～60歲，均經過血液檢查、影像學檢查和臨床檢查排除肝、膽及其他臟器疾病。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型及野生型質粒自行構建。限制性內切酶（XholⅠ和EcoRⅠ）購自大連 TaKaRa公司，普通DNA產物純化試劑盒（批號03116）購自北京天根生化技術有限公司，石蠟切片樣本DNA分離試劑盒（批號H21507150X）及血清/血漿游離DNA分離試劑盒（批號H21506020Y）均購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，TaqMan Genotyping MatserMix及ABI 7500定量PCR擴增儀均購自美國 Life Technologies公司，QX100微滴式dPCR系統和液滴穩定劑、Mini-Protean型垂直電泳儀、SYSTEM GelDoc XR IMAGELA成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 質粒DNA制備 采用限制性內切酶酶切野生型和KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型質粒，使其成為線性短鏈DNA，經普通DNA產物純化試劑盒純化后，-80℃保存備用。

1.2.3 樣本DNA制備 取ICC患者10 μm厚的石蠟包埋組織切片5張，依照石蠟切片樣本DNA分離試劑盒說明書要求抽提組織DNA，溶于100 μL洗脫液中，置-80℃保存備用。采集ICC、HCC患者手術前的靜脈血10 mL，采集正常對照者靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，900×g離心10 min，吸取上清液，16000×g再次離心10 min，以徹底去除血漿中剩余的有核細胞，根據血清/血漿游離DNA分離試劑盒說明書，提取血漿游離DNA，溶于50 μL洗脫液中，置-80℃保存備用。

1.2.4 引物及探針 參考文獻[11]，采用Primer Express軟件（美國ABI公司）分別設計KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變引物及探針。見表1。

表1 KRAS、TP53、IDH1突變引物及探針序列

1.2.5 建立dPCR檢測平臺 dPCR的原理主要是基于SYKES等[12]提出的模板無限稀釋及泊松分布定量檢測理論，在傳統PCR擴增前對樣本進行微滴化處理，將含有核酸分子的反應體系稀釋為1000萬份pL級微滴，使每個微滴分配有一個至數個待檢核酸分子或不包含待檢核酸分子，隨后經PCR擴增后，對每個微滴進行逐次檢測，根據野生型與突變型微滴種熒光信號的有無進行判讀，最終得出待測突變的豐度。反應體系：TaqMan Genotyping MatserMix 10 μL，10 μmol/L上游和下游引物各0.9 μL，10 μmol/L野生型和突變型探針各0.5 μL，模板（ctDNA）6.0 μL，去離子水1.2 μL，終體積為20 μL。反應條件：95℃酶活化10 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，60℃延伸15 s，45個循環；98℃孵育10 min，最終降溫至12℃。

1.3 dPCR平臺檢測性能評估

1.3.1 準確性評估 將KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型質粒分別配制成高、中、低（KRASG12D：5%、1%、0.5%；TP53 C242S：5%、1%、0.5%；IDH1：7.8%、1.56%、0.78%）3個豐度的標準品，每種突變類型的每個豐度重復檢測3次，要求定量結果與理論值的偏差≤±15 %。

1.3.2 精密度評估 自制KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變高、低2個豐度的混合標準品，每個豐度分裝后保存于-20℃直至檢測，批內重復檢測8次，計算批內變異系數（coefficient of variation，CV）；每批重復檢測2次，連續檢測5 d，計算批間CV。CV≤20%為符合要求。

1.3.3 空白限（limit of blank，LOB）評估 自配僅含3種基因的野生型質粒（2×105拷貝/μL），計算由錯配產生的假陽性液滴數。dPCR為絕對定量，1滴代表1拷貝。

1.3.4 功能靈敏度評估 將KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變型質粒分別倍比稀釋為20000、2000、200、20和2 拷貝/μL，各自與等量野生型質粒（2×105拷貝/μL）混合，得到濃度分別為10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%的標準品質粒。每個濃度重復檢測5次，滿足CV＜20%的標準品質粒最低分子豐度為功能靈敏度。

1.3.5 線性評估 分別重復檢測10%、5%、1%和0.1%的標準品質粒3次，各濃度的檢測偏差百分比＜15%，且曲線的回歸系數（r2）＞0.99可判斷為線性。

1.3.6 臨床應用評估 將KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C這3種突變命名為ctDNA突變譜。采用建立的ctDNA突變譜dPCR平臺檢測22例ICC患者和10例HCC患者、10名正常對照者外周血ctDNA突變情況，初步評估該平臺的檢測效能。22例ICC患者術前外周血及腫瘤組織分別采用Oseq-ctDNA及Oseq-T靶向測序平臺（華大基因公司）檢測，評估這2種平臺與自建dPCR平臺的一致性。ICC患者行切除術后每6個月采集1次外周血并跟蹤隨訪，平均隨訪時間為22.3個月，以患者死亡為隨訪終點。結合影像學及血清腫瘤標志物檢查結果，初步評估dPCR平臺在ICC患者術后療效監測及預后評估中的作用。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。采用單側泊松分布公式計算LOB。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 方法學評價

2.1.1 準確性評估KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變3個豐度的檢測結果與理論值的偏差均＜±15 %，符合要求。見表2。

表2 dPCR平臺檢測3種突變的準確性 /%

2.1.2 精密度評估KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變高、低2個豐度的批內精密度（CV）和批間精密度（CV）均＜20%，符合要求，見表3。

2.1.3 LOBKRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變的平均假陽性液滴數分別為4、3、3滴，為減少檢測臨床樣本的假陽性結果，將3種突變的LOB統一設定為4滴。見圖1。

2.1.4 功能靈敏度 dPCR平臺的功能靈敏度可達0.1%，見表4。

表3 dPCR平臺檢測3種突變高、低豐度的批內和批間精密度結果

圖1 dPCR平臺檢測3種突變的LOB評估

表4 dPCR平臺檢測3種突變的功能靈敏度 /%

2.1.5 線性評估 線性回歸分析結果顯示，KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C預期值與實測值的線性回歸方程分別為Y=0.9720X+1.029（r2=0.9987，P＜0.01）、Y=0.9757X+0.05599（r2=0.9971，P＜0.01）、Y=1.033X+0.07856（r2=0.9962，P＜0.01）。在0.1%～10.0%范圍內線性良好。見圖2。

2.2 dPCR平臺的臨床應用評估

2.2.1 dPCR平臺檢測22例ICC患者3種基因突變的結果 采用建立的dPCR平臺檢測22例ICC患者的3種基因突變，有7例患者為陽性，見表5；10例HCC患者及10名正常對照者均為陰性。

圖2 dPCR檢測3種突變的線性評估

表5 7例ICC患者3種基因突變檢測陽性結果

2.2.2 ctDNA突變譜和CA19-9單項及聯合檢測診斷ICC的效能 ROC曲線分析結果顯示，ctDNA突變譜診斷ICC 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.659，敏感性為31.8%，特異性為100%；CA19-9診斷ICC 的AUC為0.773，最佳臨界值為＞37 U/mL，敏感性為54.5%，特異性為100%；ctDNA突變譜與CA19-9聯合檢測診斷ICC的AUC為0.841，敏感性為68.2%，特異性為100%。見圖3。

2.2.3 dPCR與Oseq-ctDNA及Oseq-T靶向測序的一致性 dPCR檢測22例ICC患者外周血3種基因突變結果與Oseq-T測序結果的一致性為100%。dPCR平臺與Oseq-ctDNA測序結果有較高的一致性（kappa=0.792，P=0.007），其中患者7采用dPCR檢測到0.12%的KRASG12D突變豐度，在腫瘤組織樣本中同樣也檢測到該突變，但Oseq-T靶向測序卻未在外周血中檢測出該突變。

圖3 ctDNA突變譜和CA19-9單項及聯合檢測診斷ICC的ROC曲線

2.2.4 跟蹤隨訪 對7例dPCR陽性患者中的3例（患者3、患者9、患者7）進行治療后跟蹤隨訪，每間隔6個月檢測1次ctDNA突變譜。3例患者中有1例失訪（患者9）。患者3在行切除術后ctDNA突變譜載量顯著降低，但術后18個月時再次檢測到KRASG12D突變（豐度0.33%），同時伴有CA19-9升高（45.6 IU/L），影像學檢查確認肝內多發轉移灶，見圖4。患者7行切除術后采用GEMOX方案（吉西他濱、奧沙利鉑）進行鞏固治療，治療后ctDNA突變譜載量持續下降并最終轉為陰性，見圖5。

圖4 患者3 ICC突變基因譜、腫瘤標志物的變化及CT檢查結果

圖5 患者7 ICC突變基因譜及腫瘤標志物的變化

3 討論

ICC是僅次于HCC的第2位原發性肝臟惡性腫瘤，近年來發病率呈明顯上升趨勢[13-14]。我國的ICC患者例數遠高于歐美，約占全世界膽管癌患者的55%[15]，深入研究ICC有非常重要的意義。

由于缺乏典型的癥狀，ICC的早期診斷仍然較困難，CA19-9、CEA是目前較為有效的血清學指標，但在鑒別診斷膽道梗阻、肝內膽管結石時，其敏感性與特異性均不理想[16]。近年來，隨著液體活檢技術的興起，ctDNA檢測成為當前腫瘤研究領域的新熱點，其在腫瘤早期診斷、預后評估、復發轉移監測和療效預測等方面均具有廣闊的臨床應用前景。

ICC是存在高度異質性的腫瘤。ZOU等[7]的研究結果顯示，ICC相關的突變基因可達25個，其中8個（TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARIDA、EPKK1、ECE2、FYN）可能為驅動基因。結合本團隊前期研究結果，其中TP53、KRAS、IDH1是最常見的突變基因，所以本研究選擇了這3個基因作為檢測對象。

目前，用于血漿ctDNA檢測的技術存在靈敏度低、定量不準確等缺陷，而dPCR以其獨特的檢測原理，能在大量體細胞DNA干擾的背景下對低頻突變進行準確的絕對定量（0.01%～1.00%）檢測。因此，本研究建立了檢測KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變的dPCR平臺，并評估了該平臺的檢測性能，結果顯示，該平臺的功能靈敏度可達0.1%，與文獻報道一致[17]。在0.1%～10.0%范圍內該平臺的檢測結果呈線性，可對KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變進行準確的定量檢測。

采用dPCR平臺對22例ICC患者外周血進行檢測，ctDNA突變譜診斷ICC的敏感性為31.8%，特異性為100%，與CA19-9聯合檢測時可將敏感性提升至68.2%。由于本研究的入組例數過少，因此該平臺是否可作為ICC的輔助診斷工具還有待進一步研究。ctDNA突變的定量檢測可作為腫瘤診療隨訪的縱向觀察指標，適合對腫瘤負荷進行監測。行惡性腫瘤根治術后，患者ctDNA可降至正常水平，如不能降至正常水平，提示可能有腫瘤病灶殘留[18]。有研究結果顯示，在轉移性乳腺癌患者中，ctDNA較糖類抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）、循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）能更好地反映病情變化[19]。對2例ICC患者治療后的動態監測結果顯示，外周血ctDNA突變豐度隨患者原發病灶的切除而降低，提示本研究建立的dPCR平臺可用于ICC患者治療后的隨訪監測。另外，在治療過程中進行ctDNA突變的動態監測，可提前預警獲得性耐藥的發生。在用表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體治療結腸癌的過程中，監測ctDNA中的KRAS突變，可比常規方法提前10個月發現KRAS突變相關耐藥的發生[20]。本研究在1例ICC患者（患者3）的隨訪過程中觀察到KRASG12D突變在腫瘤切除術后18個月升高，與影像學檢查確認的復發時間一致。

目前尚無用于ICC治療的標準靶向藥物。雖然美國食品與藥品監督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）尚未批準針對本研究檢測的3個突變基因位點（KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C）的靶向藥物。但針對TP53突變的基因療法、靶向腫瘤疫苗和抗腫瘤藥物已處于臨床試驗階段，如STG-53、ALT-801、MK-1775等[21-22]，這些藥物在晚期實體腫瘤的治療中表現出了一定的療效。IDH1基因編碼異檸檬酸脫氫酶，這是一類在三羧酸循環中起重要作用的酶家族，該類酶依賴輔因子催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，是三羧酸循環中的限速步驟。IDH1基因及IDH2基因突變可導致蛋白功能受影響，突變的IDH1/IDH2編碼的異檸檬酸脫氫酶催化異檸檬酸變成2-羥戊二酸，而非α-酮戊二酸。目前，針對IDH1 R132C的靶向治療藥物有替莫唑胺[23]及AG-120[24]。替莫唑胺是一類具有抗腫瘤活性，含有咪唑四嗪環的烷化劑類抗腫瘤藥物，其本身無活性，屬于前體藥物，須在生理水平的pH值下經非酶途徑轉化為活性化合物異硫氰酸甲酯，異硫氰酸甲酯可通過DNA鳥嘌呤的O6和N2位點上的烷基化（甲基化）發揮對腫瘤的細胞毒作用。1999年，美國FDA批準替莫唑胺用于治療難治性間變型星形細胞瘤。AG-120是小分子異檸檬酸脫氫酶1抑制劑，通過特異性結合IDH1突變的構象，抑制突變構象形成2-二羥戊酸，從而抑制細胞增殖和分化。目前，AG-120用于治療攜帶IDH1突變的實體瘤患者的臨床試驗（NCT02073994）正在開展，但尚未見IDH1抑制劑替莫唑胺及AG-120用于治療攜帶IDH1突變的肝膽癌患者的報道。

綜上所述，本研究建立了檢測外周血KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變的dPCR平臺，并初步評估了該平臺的檢測性能及臨床應用價值，但由于樣本量較少，其在ICC診斷中的價值還有待增加樣本量進一步研究。初步研究結果表明該平臺可用于定量檢測外周血ctDNA突變，適用于ICC患者的輔助診斷、術后療效評估及療效動態監測等。該平臺的建立有助于推動ICC個體化治療的進展，為臨床提供更準確的患者基因突變信息。