糞便具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌DNA 檢測在結直腸癌診斷中的價值

劉 艷，龍 吟，潘偉杰，張 通，翁文浩，俞 瑩

（1.上海市第二康復醫院檢驗科，上海 200431；2.上海市楊浦區中心醫院檢驗科，上海 200090）

近年來，我國結直腸癌發病率呈逐年上升趨勢，成為繼肺癌、肝癌后居第3位的惡性腫瘤。我國2015年癌癥統計數據表明，與2005年相比，我國大腸癌新發病例數和死亡例數均在10年間翻了一番，分別達到37.7萬例和19.11萬例[1]。此外，有近20%～25%的腸癌患者在初診時發現伴有肝轉移，且晚期腸癌患者生活質量很低，盡管使用各種昂貴的化療及靶向藥物，但其5年生存率仍僅為65%。因此，結直腸癌早查篩期生物標志物相關研究成為熱點。近年來，腸道微生態與腸癌的關系正不斷被揭示。有研究發現，clbA1+大腸埃希菌具有pks致病島，并可產生大腸埃希菌素，而大腸埃希菌素可誘導宿主細胞DNA斷裂、細胞衰老，促進分泌生長因子，使細胞增殖[2]。具核梭桿菌可在結腸、直腸中富集，與腸癌患者預后有關，可促進腸癌細胞增殖、轉移和侵襲，并參與腫瘤細胞的免疫逃避、化療藥物抵抗等[3-5]。本研究擬檢測糞便樣本中clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達量，同時結合臨床診斷資料、糞便隱血試驗（fecal occult blood test，FOBT）及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）檢測結果，評價clbA+大腸埃希菌、具核梭桿菌潛在的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2017年12月—2019年1月上海市楊浦中心醫院、上海市第二康復醫院38例腺瘤患者、115例腸癌患者及58位體檢健康者（健康對照組）糞便樣本。腺瘤患者男20例、女18例，年齡（61±10）歲；腸癌患者男62例、女53例，年齡（60±11）歲，其中早期（Ⅰ～Ⅱ期）腸癌患者87例、晚期（Ⅲ～Ⅳ期）腸癌患者28例。健康對照者男31名、女27名，年齡（59±8）歲。健康對照者糞便性狀正常，FOBT結果陰性；腺瘤及腸癌患者無消化道或全身炎癥表現，未進行抗菌藥物及化療藥物治療，其糞便樣本采集于手術前。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用糞便DNA抽提試劑盒（批號為DP328，北京天根生化科技有限公司），按說明書要求進行操作。抽提后DNA濃度及質量采用Nanodropone分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）進行分析，A260nm/A280nm比值應為1.7～1.9。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測 采用實時熒光定量PCR檢測clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達量。儀器為7900HT熒光定量PCR儀（美國ABI公司），試劑為TB Green qPCR Master Mix（貨號639676，大連寶生物有限公司），按說明書要求配制反應緩沖液及DNA模板。PCR反應條件：預變性 95°C 30 s；變性95°C 10 s，退火/延伸60°C 35 s，45個循環。clbA+大腸埃希菌引物序列：上游引物為5'-AT GAGGATTGATATATTAATTGGACA-3'，下游引物為5'-GGTTTGCCATATTTGCACGTAC-3'。具核梭桿菌引物序列：上游引物為5'-TTCAAT AAAAGTGGCAGGTCAAG-3'，下游引物為5'-TAACAACACATGCAGGTCAATGG-3'。總細菌內參基因16SrDNA引物序列：上游引物為5'-CCATGAAGTCGGAATCGCTAG-3'；下游引物為5'-GCTTGACGGGCGGTGT-3'。靶細菌DNA相對表達量采用2-ΔCt表示，ΔCt=Ct靶細菌序列-Ct16SrDNA。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism及MedCalc軟件進行統計分析。呈非正態分布的數據采用中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標診斷及鑒別診斷腸癌的價值，采用χ2檢驗比較早、晚期腸癌患者各項指標陽性率的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康對照組、腺瘤組及腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達量的比較

腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA相對表達量高于腺瘤組和健康對照組（P＜0.01、P＜0.0001）。健康對照組、腺瘤組、腸癌組糞便具核梭桿菌DNA相對表達量依次升高，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達量診斷診斷腺瘤和腸癌的效能

采用Logistic回歸模型建立clbA+大腸埃希菌與具核梭桿菌聯合檢測的模型，診斷腺瘤的模型為Log（P腺瘤）=94.56447a+91.36771b－1.39321，診斷腸癌的模型為Log（P腸癌）=77.53525a+139.44605b－0.53603，式中a為clbA+大腸埃希菌DNA相對表達量，b為具核梭桿菌DNA相對表達量。ROC曲線分析結果顯示，clbA+大腸埃希菌診斷腺瘤和腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.672、0.712，診斷腸癌的最佳臨界值為0.0033，敏感性為64.32%，特異性為65.52%；具核梭桿菌診斷腺瘤和腸癌的AUC分別為0.628、0.750，診斷腸癌的最佳臨界值為0.0023，敏感性為80.87%，特異性為68.97%；聯合檢測診斷腺瘤和腸癌的AUC分別為0.723、0.761，診斷腸癌的最佳臨界值為0.5378，敏感性為80.87%，特異性為67.17%。clbA+大腸埃希菌和具核梭桿菌單項檢測及聯合檢測鑒別診斷腺瘤與腸癌的AUC分別為0.517、0.616、0.608。

表1 健康對照組、腺瘤組及腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對表達量的比較 M（P25～P75）

圖2 clbA+大腸埃希菌和具核梭桿菌的診斷效能

2.3 早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA、糞便具核梭桿菌DNA及血清CEA、FOBT陽性率的比較

早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA陽性率、糞便具核梭桿菌DNA陽性率、糞便clbA+大腸埃希菌DNA與具核梭桿菌DNA聯合檢測陽性率、FOBT陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05），晚期腸癌組血清CEA陽性率高于早期腸癌組（P＜0.05）。早期腸癌組clbA+大腸埃希菌DNA及糞便具核梭桿菌DNA單項檢測及聯合檢測的陽性率分別為75.7%、80.5%、81.6%，均高于FOBT及CEA的陽性率。見表2。

表2 早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA、糞便具核梭桿菌DNA及血清CEA、FOBT陽性率的比較 例（%）

3 討論

在大腸癌篩查的方法中，僅有FOBT和乙狀結腸鏡檢查具有高級別的循證醫學證據。FOBT是目前應用最為廣泛的篩查方法，具有無創、價廉的優點，篩查敏感性為30%～80%[6]。乙狀結腸鏡主要用于觀察遠側結腸的病變情況，敏感性為60%～70%[6]。多項臨床研究結果證實，FOBT和乙狀結腸鏡檢查對早期發現大腸癌，降低患者死亡率還不夠理想[7-8]。盡管FOBT操作簡單、成本低，但受多種因素影響，結果穩定性及敏感性均不理想，而乙狀結腸鏡檢查為創傷性操作，患者依從性差[9-10]。因此，目前尚缺少高敏感性、低創傷性的實驗室檢查手段。

糞便微生物標志物檢測具有諸多優點，如經濟有效、無創傷、人群依從性好、留取樣本簡便等。此外，糞便微生物DNA穩定、提取方法成熟且簡便。本研究以糞便具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌為研究靶點，初步探索了微生物標志物作為結直腸癌篩查工具的臨床潛在應用價值。結果顯示，健康對照者、腺瘤患者、腸癌患者具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌DNA相對表達量逐漸升高，診斷腸癌的敏感性分別為80.87%、64.32%，較文獻報道的FOBT為30%～80%[6]、乙狀結腸鏡檢查為60%～70%[6]有一定提高。此外，在早期腸癌中，具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌檢測敏感性分別為80.5%、75.7%，而CEA為25.3%，FOBT為50.6%，表明糞便具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌作為腸癌早期篩查的生物標志物具有廣闊的應用前景。

近年來，有學者提出腸癌發生的腸道微生態“驅動-被動”學說，該學說認為某些細菌具有致癌性，可驅動腸癌發生；而另一群細菌在腸癌發生過程中由于腸道內環境的變化，被動發生數量或組成的改變[11]。產腸桿菌素的大腸埃希菌可增加上皮細胞突變率[12]，為腸癌的驅動菌，而在腸癌發生過程中，轉化或腸癌細胞表面的Gal-GalNAc水平不斷增加，具核梭桿菌可通過其菌體蛋白Fap2形成Fap2/Gal-GalNAc復合物，提示具核梭桿菌可能是腸癌病變過程中不斷吸附的被動菌[13]。本研究發現clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌在腺瘤階段即開始富集，在腸癌患者中的豐度最高，表明上述細菌與腸癌發生、發展密切相關，為其作為診斷標志物提供了理論依據。

本研究發現，clbA+大腸埃希菌不能很好地鑒別腺瘤與腸癌，而具核梭桿菌具有一定的鑒別能力。有研究發現，80%的腺瘤患者存在APC等關鍵基因突變[14]，而clbA+大腸埃希菌含量很有可能在癌前病變階段已增加，對基因突變起重要作用，因此clbA+大腸埃希菌DNA相對表達量不能地很好地區分腺瘤和腸癌患者。具核梭桿菌作為被動菌在腸癌進展時才富集，因此其相對表達量可能在腸癌中更高，能起到鑒別作用。盡管clbA+大腸埃希菌和具核酸桿菌鑒別腺瘤與腸癌的作用有限，但區別健康對照者與腸癌患者的敏感性較高，因此可作為篩查標志物。

綜上所述，糞便具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌可作為潛在的結直腸癌無創性早期篩查生物標志物。通過檢測“高危”微生物，可篩查出腸癌高風險人群。鑒于本研究樣本數量有限，尚需多中心參與，以證實本研究結果。同時，隨著下一代測序技術的普及應用，新型腸癌相關微生物標志物不斷將被發現。