miR-124 靶向OSX 對牙周膜干細胞成骨分化能力的調控作用*

王獻剛 馮保靜

牙周炎是一種由牙菌斑等多種因素引起的慢性炎癥性疾病，可導致牙周組織進行性喪失，從而導致牙齒松動和脫落。近年，組織工程再生和牙周膜干細胞成為牙周疾病治療的前景和研究熱點。PDLSCs 是來源于牙周支持組織中的一群未分化細胞，具有高增殖率和多向分化潛能，在相應誘導條件下可向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞以及內皮細胞等分化，被認為是牙周組織工程中牙周改建、修復的理想材料和種子細胞[1]。牙周病的理想治療目標是實現牙周支持組織再生，而PDLSCs在牙周骨質缺損修復及組織工程再生中發揮重要作用[2]。成骨分化是一個高度協調的過程，涉及Runx2 和OSX 等多種轉錄因子，Runx2 是間充質干細胞向成骨前體細胞分化的關鍵，OSX 是成骨前體細胞向功能性成骨細胞分化的關鍵[3-5]。OSX缺失的小鼠出生后立即死亡，并顯示完全沒有骨形成[6,7]。OSX 作為成骨細胞的特異性轉錄因子可通過上調成骨細胞特異性分化標志物的表達，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、骨連接蛋白(ON)和骨橋蛋白(OPN)，從而影響骨形成[8]。在PDLSCs中OSX 基因可調控Wnt/β－catenin 信號通路從而影響牙周膜干細胞的成骨向分化[9]。因此，研究OSX 對牙周膜干細胞成骨分化能力的調控機制對牙周組織工程應用具有重要意義。

MicroRNAs (miRNAs)是非編碼家族的單鏈RNA，長度約18～25 個核苷酸，可與靶基因mRNA的3’UTRs 相結合，促進靶mRNA 降解或抑制靶mRNA 翻譯，進而介導基因抑制[10]。MicroRNA在調控間充質干細胞增殖、成骨分化能力方面具有重要作用，研究顯示miR-124 在強直性脊柱炎成骨細胞中增加GSK-3β 進而下調Wnt/β－catenin入核而抑制成骨分化過程[11]。研究表明，miR-124可通過靶向調控骨髓間充質干(BMSCs)細胞中的OSX 進而抑制成骨分化[12]。然而miR-124 是否影響牙周膜干細胞成骨分化能力及其作用機制尚不清楚。本實驗將通過研究miR-124 對牙周膜干細胞成骨分化的影響及其機制，以期為牙周膜干細胞在牙周組織修復再生應用中提供理論依據。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 細胞孵育箱(Heraeus，德國)；酶聯儀(BIO－TEK，美國)；離心機(Eppendorf，德國)；胎牛血清(Gibco，美國)；胰蛋白酶、PBS、α-MEM 培養基(Hyclone，美國)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；miR124mimics、miR124 inhibitor、si-RNA(OSX)(銳博生物公司，中國)；RIPA 蛋白裂解液、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天，中國)；OSX 抗體(貨號ab94744，Abcam，美國)；Lipofectamine2000(Invitrogen，美國)。

1.2 細胞培養及成骨誘導 經安陽市第六人民醫院倫理委員會同意，收集18～25 歲口腔科患者者即刻拔除的第三磨牙，要求牙齒健康完整無齲壞及牙周病，超凈臺內充分沖洗牙齒，使用刀片刮取牙齒根中1/3 處牙周膜，加入I 型膠原酶(3mg/L)放入細胞培養箱消化40min，每10 分鐘搖勻一次，使用含10%FBS 的培養液終止消化，去除上清后用含20%胎牛血清的α-MEM 培養液后重懸后接種于培養板中，于細胞培養箱內培養，每2 天換一次液，待細胞長至80%融合率時，挑選單克隆純化PDLSCs 后用于后續實驗。

取P3 代PDLSCs，消化重懸后接種于培養板中，分為對照組(非成骨誘導組)和成骨誘導組，當PDLSCs 達80%左右的融合率，更換成骨誘導液(10%FBS，10 mm β-甘油磷酸鈉、50ug/uL 維生素C 和10 nmol/L 地塞米松)，成骨誘導2 周后檢測miR124 及成骨基因的表達。

1.3 q-RCR 檢測目的基因mRNA 的表達取P3 代PDLSCs 接種于培養板中，分為miR124 mimics、miR124 inhibitor、miR124 對照組(miR124-NC)、control 組(圖2)及si-NC、si-OSX、miR-124 inhibitor+OSX 沉默組(miR-124+si-OSX)和miR-124inhibitor+OSX 沉默對照組(miR-124+si-NC)(圖4)，參照Lipo-2000 說明書對人PDLSCs 進行轉染，轉染48h 后提取miR124 mimics、inhibitor 和對照組細胞的總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 說明書逆轉錄合成cDNA。

1.4 Western blotting 檢測PDLSCs 中OSX蛋白的表達 取P3 代PDLSCs 接種于6 孔培養板中，分為分為miR124 mimics、miR124 inhibitor、miR124-NC、control 組(圖2)及si-NC、si-OSX、miR-124+si-OSX 和miR-124+si-NC 組(圖4)，提取各組細胞總蛋白后95℃變性5min，配制10%SDS-PAGE 膠，110mV 電壓下電泳分離細胞蛋白、70mV 電壓轉膜、5%脫脂奶粉TBST 封閉后，加入OSX(1∶1000 稀釋)抗體、β-actin(1∶10 000稀釋)抗體，于冷房過夜孵育。TBST 輕柔漂洗3次，每次10 分鐘，加入二抗后孵育1h，TBST 輕柔漂洗3 次，每次10 分鐘，ECL 化學發光后采用Image J 軟件分析結果，以OSX/β-actin 條帶灰度值表示OSX 的相對表達水平。

1.5 茜素紅實驗檢測成骨分化能力 取P3 代PDLSCs 接種于培養板中，分為miR124 mimics、miR124 inhibitor、miR124-NC、control 組(圖2)及si-NC、si-OSX、miR-124+si-OSX 和miR-124+si-NC 組(圖4)，參照Lipo-2000 說明書分別對PDLSCs 進行轉染，當細胞達到80%以上的融合率；更換成骨誘導液(10%FBS，10 mm β-甘油磷酸鈉、50ug/uL 維生素C 和10 nm 地塞米松)，成骨誘導2 周后，4%多聚甲醛加入培養板，固定細胞20min，PBS 漂洗2～3 次，加入茜素紅染液孵育15min，PBS 充分洗去茜素紅染液，顯微鏡觀察、拍照茜素紅染色結果。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗生物信息學分析預測miR-124 的靶基因，結果發現OSX 為miR-124 的靶基因，為確定miR-124 靶向結合于OSX的3’UTR 區，將OSXmRNA 突變型(OSX-MUT)和野生型(OSX-WT)的3’UTR 區合成，并連接到psiCHENK-2 載體質粒。在PDLSCs 中共轉染miR124-NC、miR124 mimics 和OSX 質粒，分組為OSX-WT+miR124 NC、OSX-MUT+miR124 NC、OSX-WT+miR124 mimics、OSX-MUT+miR124 mimics。轉染后冰上裂解細胞，檢測熒光強度并進行分析。

1.7 統計學分析 采用SPSS 19.0 統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t 檢驗或單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 PDLSCs 成骨分化前后miR-124 和OSX的表達 qPCR 檢測PDLSCs 分化后成骨基因和miR-124 的表達變化，結果顯示，PDLSCs 成骨分化后miR-124 的表達明顯下調(圖1)，而OSX、OCN、Runx2、ALP 的表達水平顯著升高(圖1)，差異具有統計學意義(P＜0.05)，結果與文獻報道一致[12]。

圖1 牙周膜干細胞成骨誘導后miR-124 和成骨相關基因的表達

2.2 miR-124 對PDLSCs 成骨分化能力的調控PDLSCs 轉染miR124 mimics 和miR124 inhibitor，q-PCR 驗證轉染效果，結果顯示miR124 inhibitor組中miR-124 的表達下調，而miR124 mimics 組中miR-124 的表達明顯上調，差異具有統計學意義(P＜0.05)(圖2)。PDLSCs 轉染miR124 后成骨誘導2 周，茜素紅結果顯示miR-124 inhibitor 組中鈣化結節明顯增多，而miR-124 mimics 組則顯著減少；q-PCR 結果顯示miR-124 inhibitor 組中OSX、ALP、Runx2、OCNmRNA 及OSX 蛋白的表達明顯上調，而miR-124 mimics 組則結果相反；差異具有統計學意義(P＜0.05)(圖2)。

圖2 miR-124 對PDLSCs 的成骨分化能力的影響

2.3 miR-124 的靶基因為OSX 生物信息學分析預測發現OSX 為miR-124 的潛在靶基因，圖2 結果顯示miR-124 mimics 組中OSX 的表達明顯低于對照組，說明OSX 可被miR-124 負向調控。采用雙熒光素酶報告基因實驗證實OSX 是miR-124 的靶基因，檢測結果顯示，OSX-WT+miR-124 組的熒光比值低于OSX-WT+miR-NC組(圖3)，差異具有統計學意義(P＜0.05)。OSXMUT+miR-124 組和OSX-MUT+miR-NC 組的熒光比值分別為0.952±0.047 和1.0±0.073，差異無統計學意義(P＞0.05)。表明miR-124 可與OSX 基因3’-UTR 位點結合，miR-124 與OSX存在直接負向調控關系。

圖3 雙熒光素酶報告驗證OSX 為miR-124 靶基因

2.4 沉默OSX 能逆轉miR-124 inhibitor 對PDLSCs 成骨向分化的促進作用 為進一步研究miR-124 和OSX 的關系，在牙周膜干細胞中同時轉染siRNA-OSX 和miR-124inhibitor，分析對PDLSCs 的成骨分化能力的影響。結果顯示，共轉染siRNA-OSX 和miR-124inhibitor 可逆轉miR-124 inhibitor 對OSX 的表達促進作用(圖4)。茜素紅染色結果可見siRNA-OSX 和miR-124 inhibitor組(miR-124+si-OSX)與miR-124 inhibitor 組相比，miR-124+si-OSX 組中鈣化結節數明顯減少(圖4)。說明沉默OSX 能夠逆轉miR-124 inhibitor對PDLSCs 的成骨分化的促進作用。

3.討論

牙周炎發病后導致牙周支持組織漸行性破壞，牙槽骨的修復弱于吸收，進而導致牙槽骨的高度降低[13]。牙周炎治療不僅要控制牙周炎癥，還要促進牙周支持組織的修復再生。因此，明確牙槽骨形成的細胞分子機制對于牙槽骨修復和牙周組織再生的至關重要。2004 年，Seo 等[1]人類牙齒牙周膜中培養出PDLSCs。PDLSCs 具有較強的自我更新能力和成骨、成脂等多向分化潛能，使PDLSCs 在牙周組織工程再生領域中擁有廣闊的應用前景[14]。本實驗探索了miR-124 對牙周膜干細胞成骨向分化能力中的影響，研究結果顯示PDLSCs 在成骨分化后miR-124 的表達水平呈現下調趨勢，而OSX的表達則顯著升高。通過inhibitor 抑制miR-124的表達可上調牙周膜干細胞的成骨分化能力，并可促進OSX mRNA 和蛋白的表達，miR-124 與OSX的表達呈負相關，結果與文獻報道相一致[12]。OSX作為一種調控細胞成骨分化的轉錄因子，可特異性調控多種成骨相關基因的轉錄[7]。OSX 的表達是成骨前體細胞向成骨細胞分化的必要條件，OSX 基因的轉錄表達可調控成骨細胞的晚期分化，當OSX 基因缺失時，則成骨細胞分化則基本完全被抑制[6]。此外，成牙本質細胞中條件性敲除OSX的小鼠可表現出短而薄的牙根表型，說明在牙根發育過程中OSX 發揮了重要作用[15]。機制研究表明，OSX 表達的調控網絡可以通過調控上皮BMP 信號通路、間質Runx2 表達和細胞磷酸化水平來調控[16]。綜上，OSX 對細胞成骨分化能力具有重要的調控作用，因此研究OSX 在PDLSCs 中的調控機制對牙周支持組織再生具有重要意義。為了進一步了解OSX 在PDLSCs 的作用機制。本研究通過生信分析發現OSX 為miR-124 的潛在作用靶點，雙熒光素酶實驗驗證結果顯示與OSX 突變組相比，OSX-WT+miR-124 組的相對熒光素酶活性顯著抑制，而OSX-WT+miR-NC 組的無顯著變化，表明miR-124 可與OSX 的3’-UTR 位點結合，兩者存在直接負向調控關系。有研究表明miR-124可靶向結合OSX 進而抑制骨髓間充質干細胞體外成骨分化能力[12]，與本實驗結果相一致。MicroRNAs(miRNAs)是一種在結構上不同于雙鏈小干擾RNA(siRNA)的非編碼RNA，作用機制也與siRNA 介導的mRNA 基因沉默有所區別，miRNA-RISC結合復合體對靶基因降解效能主要取決于其與mRNA 轉錄本3’-UTR 序列互補的程度。本實驗中miR-124 與OSX 的3’-UTR 序列高度互補，并證實miR-124 與OSX 互補結合后導致OSX mRNA 發生降解，抑制其翻譯效率，進而影響OSX 蛋白的表達。本研究結果顯示miR-124 可能是一個新的調控成骨分化的重要路徑，參與了OSX 基因介導的PDLSCs 成骨分化進程，這對牙周組織損傷修復時的骨改建具有重要意義。

本研究采用雙熒光素酶報告系統證實了miR-124 結合與OSXmRNA3’-UTR 區，即OSX 為miR-124 的靶基因，最后miR-124 inhibitor 和OSX-siRNA 共轉染實驗進一步證實了沉默OSX可逆轉miR-124 inhibitor 對PDLSCs 成骨分化能力的促進作用。綜上所述，miR-124 通過靶向負調控OSX 對牙周膜干細胞的成骨分化產生抑制作用，提示miR-124 在牙周膜干細胞和組織損傷修復過程中發揮重要作用。