新型唾液生物標記物在口腔癌檢測的研究進展

李惠芳 張 芳

口腔和口咽癌位居全身惡性腫瘤第6 位，90%以上為鱗狀細胞癌[1]。就醫意識弱，臨床存在誤診、不當治療等，患者確診時已處于晚期。研究顯示，OSCC 在T1 階段確診、治療，5 年生存率為80%以上；晚期確診，僅20%～30%[2]；OSCC、口腔白斑高危人群的篩查可早期發現OSCC[3]。因此，口腔癌的早期診斷，特別在T1 階段，甚至與口腔癌前病變區分，具有重要意義[2]。

口腔癌確診“金標準”為病理學檢查，有創且依賴專業人員。唾液包含較多反映機體病理、生理狀態的生物學信息，收集方便無創，多次可靠，唾液組學在全身疾病的研究得到廣泛關注[4]。過去20年，學者們已發現100 余種口腔癌唾液潛在標記物[5]，轉錄組學和蛋白質組學標雖表現出較好預測值，但標記物聯合運用，曲線下面積(Area Under Curve,AUC)仍未達0.90 理想水平[6]。

近五年，新的唾液標記物被發現，已知標記物的研究進一步深入，唾液蛋白組學、代謝組學庫被建立、完善，新型唾液標記物較傳統標記物體現出以下優勢：(1)唾液標記物或測定板顯示較高的AUC(單獨或聯合運用甚至超過0.90)、靈敏度和特異性；(2)不受口腔癌危險因素、慢性牙周炎影響；(3)部分標記物具有性別差異。這些優勢為其早日用于臨床提供可能。因此，本文就新型唾液生物標記物(表1)在口腔癌檢測的研究進展作一綜述。

1.基因組學

多種形式的基因突變可影響蛋白合成，導致口腔癌發生。過去研究顯示，p53 基因突變在唾液與組織具有一致性，近幾年口腔癌唾液基因組學的研究熱點集中于甲基化。

Liyanage 等[7]研究了54 例口腔癌患者和60 例健康人群唾液p16INK4a、RASSF1A、TIMP3、PCQAP/MED15 抑癌基因的表達，發現四者聯合AUC、準確性、靈敏度、特異性為0.92、0.92、91.7%、92.3%，10 倍交叉實驗(模擬臨床運用效果)為0.85、0.87、83.3%、92.3%，排列測驗(模擬臨床運用效果)為0.71、0.71、69.7%、76.0%，四者聯合具有從健康人群區分口腔癌的高效性，有望成為口腔癌篩查的理想工具。

Arantes 等[8]對OSCC 患者和健康人群各40 例唾液進行研究，發現甲基化的CCNA1、DAPK、DCC 和TIMP3 在OSCC 具有高特異性，與臨床特征(性別年齡、HPV、臨床分期、血管栓塞和神經浸潤)無關，早期檢測OSCC 有較好效果：CCNA1 的AUC、靈敏度、特異性為0.638、30.0%、100.0%，DAPK 為0.813、80.0%、82.5%，DCC 為0.825、70.0%、95.0%，TIMP3 為0.913、82.5%、100.0%，CCNA1+DCC+TIMP3 為0.925、92.5%、92.5%，DCC+TIMP3 為0.925、90.0%、95.0%，CCNA1+TIMP3 為0.913、85.0%、97.5%。這些標記物表現出檢測OSCC 的潛力，有望臨床運用該測定板。

LDOC1 是一種X 連鎖腫瘤抑制因子基因，通過NF-κB 通路調節細胞增殖，與卵巢癌、宮頸癌等相關。Liu 等[9]qRT-PCR 檢測了53 例OSCC患者和43 例健康對照者唾液LDOC1，發現女性OSCC 組顯著上調，男性OSCC 組顯著下調；然而，約60%的男性OSCC 患者有吸煙史(79.1%)、嚼檳榔史(66.6%)。高表達的LDOC1 有望成為女性OSCC 唾液標記物，低表達的LDOC1 能否排除吸煙、嚼檳榔等影響成為男性OSCC 標記物，有待進一步研究。

2.轉錄組學

轉錄組學參與基因表達調控、蛋白合成修飾。唾液易檢出大量RNA，主要包括mRNAs、miRNAs，近年circRNAs、lncRNAs 開始受到重視。

mRNAs 雖只占細胞總RNA 的2%～5%，但種類最多、代謝活躍，可反映機體生理和病理狀態。健康人唾液上清約3000 種mRNA，DUSP-1、H3F3A、IL-Iβ、IL-8、OAZ-1、SAT 和S100P的聯合運用顯示較高靈敏度和特異性[10]。唾液炎性狀態影響唾液mRNAs 表達，Cheng 等[11]發現，OSCC 與中重度慢性牙周炎患者(無論吸煙與否)、健康人群相比，以上7 種mRNA 僅S100P 升高。唾液S100P mRNA 表達不受慢性牙周炎影響，有望成為OSCC 唾液潛在標記物。

miRNAs 是長約21～23 個核苷酸的非編碼RNA，占人類基因的1%～5%，卻調節約30%蛋白編碼基因，與細胞生長、分化、發育和凋亡相關。miR-125a、miR-200a、miR-31 是已被報道的口腔癌唾液潛在標記物。近年發現，唾液miRNAs可由細胞外囊泡分泌，Gai 等[12]首次評估其在OSCC的表達，發現miR-302b-3p、miR-517b-3p 僅在OSCC 組表達；miR-412-3p、miR-512-3p 在OSCC 較健康對照組表達上調，AUC 分別為0.871、0.847。提示四者可作為OSCC 檢測的可靠唾液標記物。

circRNAs 是一種無5' 帽或3' 聚尾的共價閉環結構，穩定性好、平均半衰期長，可對抗RNA外切酶、與miRNAs 結合抑制其活性。Zhao 等[13]微陣列篩選出OSCC 組12 個上調、20 個下調唾液circRNAs；隨后對90 例OSCC 唾液qRT-PCR，發現OSCC 較健康對照組上調的hsa＿circ＿0001874AUC、靈敏度、特異性為0.863、74.44%、90.24%，下調的hsa＿circ＿0001971 為0.845、75.56%、87.80%，聯合運用為0.922、92.68%、77.78%，卡方檢驗顯示二者與TNM 分期、腫瘤病理分級相關。

lncRNAs 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，可影響染色質重塑和甲基化、抑制miRNAs、調節蛋白質復合物的穩定性。57 例OSCC 組織的研究顯示，OSCC 與健康對照組有160 個差異表達lncRNAs[14]。MALAT-1、HOTAIR 是目前熱點lncRNA，Tang 等[15]qPCR 研究了9 例OSCC 唾液，發現所有患者均表達MALAT-1；5 位表達HOTAIR，4 例淋巴結轉移患者中3 例陽性表達。唾液lncRNAs 在口腔癌的研究尚處起步階段，值得關注。

3.蛋白質組學

蛋白質是遺傳信息的最終產物，唾液蛋白質組學在闡明致病機制、靶向治療等方面具有重要意義。MMP-9、白細胞介素是已被報道的口腔癌唾液潛在標記物。近年新發現139 種唾液蛋白可能與口腔癌相關[16]，完善了口腔癌唾液蛋白庫。

PRDX-2 屬于硫醇特異性抗氧化酶家族，介導與細胞增殖、凋亡調節相關的多種信號通路；ZAG 屬于巨球蛋白家族，與抑制腫瘤生長、上皮間質轉化和激活凋亡相關。Heawchaiyaphum 等[17]研究了72 例OSCC 和78 例無癌對照組，發現二者在OSCC 唾液顯著上調，不受危險因素(吸煙嗜酒、嚼檳榔、人乳頭瘤病毒和EB 病毒)影響；檢測早期OSCC，PRDX-2AUC、靈敏度、特異性為0.959、95%、93.83%，ZAG 為0.904、85%、100%，二者聯合為0.999、100%、98.77%。提示二者單獨或聯合可作為OSCC 早期檢測的可靠唾液標記物。

Wu 等[18]通過ELISA 與懸浮陣列結合的多路復用面板，研究了131 例OSCC、42 例低風險、44例高風險口腔癌前病變患者和131 例健康人群唾液，發現早期OSCC 較健康個體抗p53、生存素、Hsp60、RPLP0 抗體顯著升高，與高分化OSCC相關，與臨床特征(年齡、吸煙嗜酒、嚼檳榔、部位分期、淋巴結有無轉移)不相關；將特異性確定為90%，四者檢測OSCC 靈敏度分別23.7%、20.6%、17.6%、23.7%、29.0%，檢測高分化OSCC 為30%、31.7%、23.3%、33.3%、38.3%，聯合區分OSCC、低風險、高風險口腔癌前病變、高分化OSCC 為43.5%、31.0%、38.6%、56.7%。唾液自身抗體聯合測定板具有早期檢測OSCC 潛力，靈敏度有待提高。

Yu 等[19]通過LC-多重反應監測質譜定量131例OSCC、103 例低風險、130 例高風險口腔癌前病變患者、96 例健康人群49 種唾液蛋白，生成MMP1、KNG1、ANXA2、HSPA5 測定板：MMP1的AUC、靈敏度、特異性為0.871、69.5%、95.0%，KNG1 為0.870、84.0%、75.4%，ANXA2 為0.816、80.2%、68.3%，HSPA5 為0.680、90.1%、39.7%；四蛋白測定板靈敏度、特異性分別87.5%、80.5%，能檢測88.6%的早期OSCC 和91.6%的OSCC，亦可評估高危口腔潛在惡變風險，有望運用至臨床。

4.代謝組學

唾液代謝組學與機體生理、病理狀態相關，反映基因、RNA、蛋白質的效應，表達存在性別、年齡、吸煙、受刺激狀態等差異，既往口腔癌唾液代謝組學研究涉及甜菜堿、透明質酸、氨基酸等。

新近研究表明，VOCs(揮發性有機化合物)與機體病理狀態強相關。Shigeyama 等[20]首次通過ZSM-5/聚二甲基硅氧烷雜化膜與氣相色譜-質譜聯用的薄膜微萃取技術，研究了12 例OSCC 與8 例健康對照組唾液，發現兩組分別有42、73 種內源性VOCs(35 種相同)，12 種在OSCC 表達頻率改變；3-庚酮、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇僅在OSCC 的T1、T2 階段表達。該研究建立了OSCC患者和健康人群唾液代謝組學特征，并初步探討VOCs 作為OSCC 唾液潛在標記物。

Ishikawa 等[21]運用毛細管電泳質譜分析了24例口腔癌患者和44 例健康對照者未受刺激全唾液親水代謝物，發現45 種有統計學差異，SAM 聯合甲基哌啶從健康人群篩查口腔癌AUC 為0.827。差異表達的唾液代謝物有望用于口腔癌篩查；SAM聯合甲基哌啶檢測效果較好，單獨運用不甚明確。

5.口腔微生物群

口腔微生物群包括細菌、病毒、真菌，口腔癌致病因素影響微生物群組成。近年，宏基因組技術有助于研究口腔癌微生物基因組、毒力特性及與機體免疫的相互作用。

Yang 等[22]對197 例不同時期OSCC 和51 例健康個體口腔漂洗樣本的微生物測序，發現梭菌屬(牙周梭桿菌、微小單胞菌、星狀鏈球菌、流感嗜血桿菌和產線梭桿菌AUC 分別0.864、0.883、0.856、0.696、0.800)豐度增加，而鏈球菌(輕型鏈球菌0.780)、嗜血桿菌(副流感嗜血桿菌0.805)、卟啉單胞菌(黏卟啉單胞菌0.857)和放線菌屬隨OSCC 進展減少，牙周梭桿菌、輕型鏈球菌、黏卟啉單胞菌三菌屬研究測定板區分IV 期OSCC 與健康對照組AUC 為0.956。

Lim 等[23]同法分析了52 例口腔、口咽癌患者、11 例高危人群和10 例健康人群口腔漂洗樣本，測定出6 個已知門類和28 個菌屬，羅氏菌、嗜血桿菌、棒狀桿菌、桿狀桿菌、卟啉單胞菌、嗜二氧化碳細胞菌低豐度表達于口腔癌和口咽癌組，毛螺旋菌則高表達，七菌屬測定板AUC、靈敏度、特異性分別0.98、100%、90%，雙重交叉實驗為0.82、90%、61%，該測定板有望用于臨床檢測。

6.小結

相比既往研究，新型口腔癌唾液標記物AUC較高，不受危險因素、慢性牙周炎等影響，為探尋理想標記物提供諸多新進展。期待在以下方面有更深入研究：1.全面測定標記物單獨或聯合AUC，確定靈敏度、特異性最佳結合點，聯合交叉驗證、排列實驗等，篩選理想標記物；2.統一檢測技術質控標準，使研究數據具有可比性；3.對照組設定更多考慮口腔癌危險因素、慢性牙周炎等對特異性的影響；4.關注標記物在口腔癌前病變或狀態的差異表達，以評估癌變風險。綜上，新型口腔癌唾液標記物及聯合測定板顯示較好的檢測效果，但臨床檢測、早期篩查效果暫不明確；加快臨床運用并驗證可靠性及重復性，成為亟待解決的問題。