高正加速度對(duì)嚼肌肌細(xì)胞的影響及黃芪的防護(hù)作用*

吳 群 石夢琪 劉慜妮 張 琰 鄂玲玲 劉洪臣

高性能戰(zhàn)機(jī)在飛行中所產(chǎn)生的正加速度常用G值表示，具有G 值高、增長快、持續(xù)時(shí)間長的特點(diǎn)。當(dāng)G 值超過飛行員的生理耐受限度時(shí)，會(huì)對(duì)飛行員的身心造成影響，成為影響飛行安全的重要因素[1]。飛行過程中，高正加速度對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)均產(chǎn)生不同程度的影響，目前多數(shù)研究表明，高正加速度對(duì)機(jī)體心血管、意識(shí)、骨骼等系統(tǒng)均有影響，例如，在高正加速度狀態(tài)下可引起舌橫紋肌細(xì)胞間質(zhì)稀疏、部分排列紊亂等損傷[2,3]。但飛行過程中對(duì)嚼肌損傷及防護(hù)的報(bào)道比較少。本實(shí)驗(yàn)以高+Gz值暴露下的大鼠模型為研究對(duì)象，通過組織學(xué)觀察、檢測bcl-2、bax、Caspase-3、細(xì)胞色素C的表達(dá)，探討高正加速度對(duì)嚼肌肌細(xì)胞的影響以及黃芪(astragalusmembranaceus,AM)的防護(hù)作用，以尋求一種防護(hù)方法及探討其作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料 選健康雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，5 周齡，體重在180g-220g(解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001；模擬加速度動(dòng)物離心機(jī)(空軍507 航空研究所)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的手術(shù)器械、生理鹽水(0.9%Nacl，250ml/瓶，安徽雙鶴藥業(yè)責(zé)任有限公司)國藥準(zhǔn)字：H34023608)；AM 注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020179，10ml/支，2g/ml)。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 30 只SD 大鼠(雄性，200g)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱重，隨機(jī)分5 組。分別為：對(duì)照組，+10Gz 組，+10Gz+低劑量黃芪組(+10Gz+LAM)，+10Gz+中劑量黃芪組(+10Gz+MAM)，+10G+高劑量黃芪組(+10Gz+HAM)，每組6 只，分籠飼養(yǎng)并做標(biāo)記。各組動(dòng)物每天上午腹腔注射給藥一次，連續(xù)14 天，給藥劑量為10ml/kg，低濃度組，中濃度組，高濃度組的AM 濃度分別為0.5g/ml，1g/ml，2g/ml，對(duì)照組、+10Gz 組給予等量的生理鹽水注射。除對(duì)照組外，其余4 組均在完成14 天腹腔注射處理后次日接受+10Gz 正加速度處理。

1.2.2 模擬高正加速度大鼠模型制備 +Gz 暴露方式：采用離心機(jī)模擬+Gz 暴露，利用特制固定裝置承載大鼠，固定于動(dòng)物離心機(jī)轉(zhuǎn)臂上，大鼠頭朝向離心機(jī)，離心半徑1.9m，每只大鼠專用一個(gè)固定盒。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12h，實(shí)驗(yàn)組大鼠暴露于+10Gz 條件下，持續(xù)5min，加速度增長率1G/s，由計(jì)算機(jī)控制；對(duì)照組不做任何處理。大鼠經(jīng)高G值暴露4 小時(shí)后頸椎脫臼法處死，立即交替取雙側(cè)嚼肌分別供組織學(xué)觀察、RT-PCR 及Western blot檢測。

1.2.3 組織學(xué)觀察 將嚼肌組織標(biāo)本置于4%的多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1M,pH=7.4)中固定24h 后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切片,切片厚度5μm。再按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)進(jìn)行脫蠟、染色、封片。

1.2.4 RT-PCR 法檢測bcl-2、Bax 的表達(dá)取凍存的組織樣品研磨，以每1mlTrizol 液0.2ml的比例加入氯仿進(jìn)行抽提，用異丙醇沉淀，回收總RNA，溶于DEPC 水中。取5μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為：50℃、50min，85℃、5min，立即放置到冰上。引物序列分別為：Bax-F：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，Bax-R：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT，bcl-2-F:GGTGGGGTCATGTGTGTGG，bcl2-R:CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC，內(nèi)參GAPDH-F：AC AACTTTGGTATCGTGGAAGG，GAPDH-R:GCCATCACGCCACAGTTTC。PCR 反應(yīng)條件為：95℃,2 min 0 secs，95℃,hold 10 secs，60℃,hold 30 secs。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，取10μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂凝膠電泳，應(yīng)用ABI7900(SDS2.3 軟件)進(jìn)行分析。

1.2.5 Western-blot 法檢測Caspase-3 和細(xì)胞色素C 的表達(dá) 取各組嚼肌組織50～100mg，取總蛋白，測定蛋白濃度，進(jìn)行定量，取各個(gè)組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度，3000 轉(zhuǎn)/min 離心1min。每孔加樣液20μg，恒壓電泳，約30min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出PVDF 膜，放入5%BSA室溫封閉2h。取出膜，于搖床上用TBST 洗膜5min×3 次。孵育袋中加入封閉液稀釋的cytochromeC(博士德1∶200)、caspase-3(abcam 1∶200)和GAPDH (weiao 1∶2000)，4℃孵育過夜。TBST 洗膜5min×3 次，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jackson 1∶2000)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(Jackson 1：2000)室溫孵育2h。TBST 洗膜15min×5 次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑(試劑A∶試劑B＝1∶1)反應(yīng)2min，取出膜，感光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用mean±SD表示，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 嚼肌組織學(xué)改變 大鼠嚼肌組織學(xué)改變見圖1。正常組大鼠嚼肌肌纖維排列整齊，粗細(xì)均勻，肌肉橫紋清晰；+10Gz 組的嚼肌縱切面見肌血管擴(kuò)張，組織充血，部分肌纖維扭曲、橫紋消失，出現(xiàn)肌肉收縮帶，部分甚至出現(xiàn)個(gè)別肌纖維壞死溶解，細(xì)胞核向中央移位見“核串”，橫切面見部分肌纖維橫徑變小，纖維呈棱角形；AM 低中高各濃度組肌肉組織學(xué)改變程度逐漸減輕，高濃度組肌肉組織學(xué)改變程度最輕。

圖1 各組大鼠嚼肌組織病理特征

2.2 嚼肌細(xì)胞Bax,bcl-2 mRNA 表達(dá) 嚼肌細(xì)胞Bax,Bcl-2 mRNA 表達(dá)詳見表1 和圖2。

表1 不同處理情況下，大鼠咀嚼肌細(xì)胞內(nèi)Bax 和Bcl-2 的表達(dá)(平均值±SD,n=6)

圖2 咀嚼肌細(xì)胞內(nèi)Bax 和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)

如表1 和圖2 的結(jié)果顯示，+10Gz 組同正常組相比較，Bax 的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，Bcl-2 的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，AM 注射液中，高濃度組較+10Gz 組Bax 表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，Bcl-2 表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)；但低濃度組與+10Gz 組相比，Bax、Bcl-2 表達(dá)水平與+10Gz 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 嚼肌細(xì)胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表達(dá) 嚼肌細(xì)胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表達(dá)詳見圖3 和表2。

圖3 大鼠咀嚼肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3 和Cytochrome C 的蛋白表達(dá)

表2 不同處理情況下大鼠咀嚼肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3 和Cytochrome C的表達(dá)(平均值±SD,n=6)

如圖3 和表2 所示，+10Gz 組同正常組相比，caspase-3 和細(xì)胞色素C 的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)；黃芪注射液各濃度組的caspase-3 和細(xì)胞色素C 表達(dá)水平較+10Gz 組表達(dá)水平均有所降低，除低濃度組細(xì)胞色素C 表達(dá)水平與+10Gz 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

3.討論

G 值是指飛機(jī)飛行時(shí)產(chǎn)生的由頭至腳方向的加速度，高+Gz 是指加速度大于7 G，持續(xù)性是指空中戰(zhàn)機(jī)動(dòng)或特技飛行時(shí)連續(xù)兩個(gè)空中戰(zhàn)動(dòng)作循環(huán)，持續(xù)6～15s[4]。在高+Gz 下可引起嚼肌損傷，組織變形移位，部分肌纖維扭曲、斷裂、橫紋消失[5]。因而探索如何減輕高正加速度對(duì)嚼肌的損傷是本實(shí)驗(yàn)的目的所在。本實(shí)驗(yàn)中大體標(biāo)本嚼肌形態(tài)學(xué)顯示：+10Gz 組嚼肌肌內(nèi)血管擴(kuò)張，組織充血，部分肌纖維扭曲、橫紋消失，出現(xiàn)肌肉收縮帶，少量甚至出現(xiàn)個(gè)別肌纖維壞死溶解,細(xì)胞核向中央移位見“核串”，+10Gz 組的嚼肌的橫切面見部分肌纖維橫徑變小，纖維呈棱角形。+10Gz 組嚼肌組織學(xué)改變明顯較AM 各濃度組嚴(yán)重；AM 各濃度組隨著AM 濃度增高，嚼肌損傷表現(xiàn)逐漸減輕，+10Gz+HAM 組嚼肌形態(tài)改變最小，+10Gz+LAM 組嚼肌形態(tài)學(xué)改變最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高+Gz 暴露可致嚼肌損傷，高+Gz 暴露前應(yīng)用AM 注射液具有保護(hù)作用，且與劑量相關(guān)。

目前中藥成為細(xì)胞損傷保護(hù)的研究點(diǎn)，黃芪(Astragalusmembranaceus,AM)是其中的一種，黃芪注射液是提取AM 的有效成分制成的水溶液，主要成分：AM 皂苷類、黃酮、氨基酸、多糖及微量元素，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)細(xì)胞代謝，強(qiáng)心降壓，改善血液循環(huán)及抗衰老等作用。AM 能有效地對(duì)抗腦、腎、腸等臟器缺血再灌注損傷，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，降低中性粒細(xì)胞浸潤，減少細(xì)胞凋亡[5,6]。鑒于AM 具備的多種功效，本實(shí)驗(yàn)探索性的嘗試用AM 保護(hù)高+Gz 值暴露對(duì)咀嚼肌的損傷，組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，AM 具有一定保護(hù)作用，且與劑量有關(guān)。

細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)[7]。在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡機(jī)制和細(xì)胞凋亡核心，其功能及作用越來越受到關(guān)注[8,9]而這一通路的激活又依賴線粒體膜電位的下降以及線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C 釋放到胞質(zhì)，觸發(fā)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞色素C和Caspase-3 分別作為線粒體凋亡途徑的啟動(dòng)和關(guān)鍵執(zhí)行因子，在細(xì)胞凋亡中有著不可替代的地位，也是檢測線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[11]。有研究表明[12,13]，Bcl-2 對(duì)線粒體外膜通道的穩(wěn)定起重要作用。各種凋亡刺激信號(hào)可通過BH3-only 蛋白引起B(yǎng)ax 蛋白移位到線粒體外膜并多聚化，形成膜通道，從而使線粒體的許多功能發(fā)生致命性的改變，使原先位于線粒體內(nèi)的參與細(xì)胞凋亡的相關(guān)活性物質(zhì)釋放出來，如細(xì)胞色素C(Cytochrome C)等，進(jìn)而激活Caspase-3 蛋白酶，啟動(dòng)不可逆的細(xì)胞凋亡途徑。

我們在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，+10Gz 暴露大鼠咀嚼肌出現(xiàn)TUNEL 染色陽性細(xì)胞，且顯著增多(P＜0.01)，提示+10Gz 暴露可導(dǎo)致咀嚼肌細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用RT-PCR 法及Westernblot 法檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2mRNA、BaxmRNA及胞漿內(nèi)的Caspase-3 和細(xì)胞色素C 蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌細(xì)胞BaxmRNA 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2mRNA 表達(dá)水平顯著降低以及caspase-3 和細(xì)胞色素C 蛋白表達(dá)水平顯著升高；預(yù)先應(yīng)用AM 可以抑制上述mRNA 和蛋白的異常表達(dá)，并且呈劑量依賴性。Bax 表達(dá)增高，有利于線粒體膜上形成通透性孔道，而Bcl-2 表達(dá)降低則進(jìn)一步促進(jìn)通透性孔道的形成，從而使細(xì)胞色素C 釋放、Caspase-3 活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)發(fā)生改變，AM 的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。

戰(zhàn)機(jī)高正加速度可致嚼肌損傷、肌細(xì)胞凋亡，中藥黃芪可能通過抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的異常表達(dá)，保護(hù)嚼肌免受+10Gz 暴露的傷害，且有濃度依賴性，隨著濃度的增加，保護(hù)作用增強(qiáng)，對(duì)飛行員的訓(xùn)練及防護(hù)有指導(dǎo)性作用。但黃芪通過何種通路導(dǎo)致嚼肌細(xì)胞凋亡降低尚待進(jìn)一步研究。