高正加速度對嚼肌肌細胞的影響及黃芪的防護作用*

吳 群 石夢琪 劉慜妮 張 琰 鄂玲玲 劉洪臣

高性能戰機在飛行中所產生的正加速度常用G值表示，具有G 值高、增長快、持續時間長的特點。當G 值超過飛行員的生理耐受限度時，會對飛行員的身心造成影響，成為影響飛行安全的重要因素[1]。飛行過程中，高正加速度對機體各個系統均產生不同程度的影響，目前多數研究表明，高正加速度對機體心血管、意識、骨骼等系統均有影響，例如，在高正加速度狀態下可引起舌橫紋肌細胞間質稀疏、部分排列紊亂等損傷[2,3]。但飛行過程中對嚼肌損傷及防護的報道比較少。本實驗以高+Gz值暴露下的大鼠模型為研究對象，通過組織學觀察、檢測bcl-2、bax、Caspase-3、細胞色素C的表達，探討高正加速度對嚼肌肌細胞的影響以及黃芪(astragalusmembranaceus,AM)的防護作用，以尋求一種防護方法及探討其作用機制。

1.材料與方法

1.1 材料 選健康雄性SD 大鼠，SPF 級，5 周齡，體重在180g-220g(解放軍總醫院實驗動物研究中心)許可證號SCXK(京)2012-0001；模擬加速度動物離心機(空軍507 航空研究所)；動物實驗的手術器械、生理鹽水(0.9%Nacl，250ml/瓶，安徽雙鶴藥業責任有限公司)國藥準字：H34023608)；AM 注射液(正大青春寶藥業有限公司，國藥準字Z33020179，10ml/支，2g/ml)。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 30 只SD 大鼠(雄性，200g)適應性喂養一周后，稱重，隨機分5 組。分別為：對照組，+10Gz 組，+10Gz+低劑量黃芪組(+10Gz+LAM)，+10Gz+中劑量黃芪組(+10Gz+MAM)，+10G+高劑量黃芪組(+10Gz+HAM)，每組6 只，分籠飼養并做標記。各組動物每天上午腹腔注射給藥一次，連續14 天，給藥劑量為10ml/kg，低濃度組，中濃度組，高濃度組的AM 濃度分別為0.5g/ml，1g/ml，2g/ml，對照組、+10Gz 組給予等量的生理鹽水注射。除對照組外，其余4 組均在完成14 天腹腔注射處理后次日接受+10Gz 正加速度處理。

1.2.2 模擬高正加速度大鼠模型制備 +Gz 暴露方式：采用離心機模擬+Gz 暴露，利用特制固定裝置承載大鼠，固定于動物離心機轉臂上，大鼠頭朝向離心機，離心半徑1.9m，每只大鼠專用一個固定盒。實驗前大鼠禁食12h，實驗組大鼠暴露于+10Gz 條件下，持續5min，加速度增長率1G/s，由計算機控制；對照組不做任何處理。大鼠經高G值暴露4 小時后頸椎脫臼法處死，立即交替取雙側嚼肌分別供組織學觀察、RT-PCR 及Western blot檢測。

1.2.3 組織學觀察 將嚼肌組織標本置于4%的多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1M,pH=7.4)中固定24h 后進行常規石蠟包埋,切片,切片厚度5μm。再按實驗室常規進行脫蠟、染色、封片。

1.2.4 RT-PCR 法檢測bcl-2、Bax 的表達取凍存的組織樣品研磨，以每1mlTrizol 液0.2ml的比例加入氯仿進行抽提，用異丙醇沉淀，回收總RNA，溶于DEPC 水中。取5μg RNA 進行逆轉錄。逆轉錄條件為：50℃、50min，85℃、5min，立即放置到冰上。引物序列分別為：Bax-F：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，Bax-R：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT，bcl-2-F:GGTGGGGTCATGTGTGTGG，bcl2-R:CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC，內參GAPDH-F：AC AACTTTGGTATCGTGGAAGG，GAPDH-R:GCCATCACGCCACAGTTTC。PCR 反應條件為：95℃,2 min 0 secs，95℃,hold 10 secs，60℃,hold 30 secs。循環擴增結束后，取10μL 反應產物進行2%的瓊脂凝膠電泳，應用ABI7900(SDS2.3 軟件)進行分析。

1.2.5 Western-blot 法檢測Caspase-3 和細胞色素C 的表達 取各組嚼肌組織50～100mg，取總蛋白，測定蛋白濃度，進行定量，取各個組蛋白提取液，調整蛋白濃度，3000 轉/min 離心1min。每孔加樣液20μg，恒壓電泳，約30min，轉膜結束后，快速取出PVDF 膜，放入5%BSA室溫封閉2h。取出膜，于搖床上用TBST 洗膜5min×3 次。孵育袋中加入封閉液稀釋的cytochromeC(博士德1∶200)、caspase-3(abcam 1∶200)和GAPDH (weiao 1∶2000)，4℃孵育過夜。TBST 洗膜5min×3 次，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(Jackson 1∶2000)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠二抗(Jackson 1：2000)室溫孵育2h。TBST 洗膜15min×5 次。膜于化學發光檢測試劑(試劑A∶試劑B＝1∶1)反應2min，取出膜，感光、顯影、定影。

1.3 統計學處理 采用Graph Pad Prism 6.0統計軟件對數據進行方差分析，數據用mean±SD表示，組間兩兩比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 嚼肌組織學改變 大鼠嚼肌組織學改變見圖1。正常組大鼠嚼肌肌纖維排列整齊，粗細均勻，肌肉橫紋清晰；+10Gz 組的嚼肌縱切面見肌血管擴張，組織充血，部分肌纖維扭曲、橫紋消失，出現肌肉收縮帶，部分甚至出現個別肌纖維壞死溶解，細胞核向中央移位見“核串”，橫切面見部分肌纖維橫徑變小，纖維呈棱角形；AM 低中高各濃度組肌肉組織學改變程度逐漸減輕，高濃度組肌肉組織學改變程度最輕。

圖1 各組大鼠嚼肌組織病理特征

2.2 嚼肌細胞Bax,bcl-2 mRNA 表達 嚼肌細胞Bax,Bcl-2 mRNA 表達詳見表1 和圖2。

表1 不同處理情況下，大鼠咀嚼肌細胞內Bax 和Bcl-2 的表達(平均值±SD,n=6)

圖2 咀嚼肌細胞內Bax 和Bcl-2 mRNA 的表達

如表1 和圖2 的結果顯示，+10Gz 組同正常組相比較，Bax 的表達水平顯著升高(P＜0.05)，Bcl-2 的表達水平顯著降低(P＜0.05)，AM 注射液中，高濃度組較+10Gz 組Bax 表達水平顯著降低(P＜0.01)，Bcl-2 表達水平顯著增高(P＜0.01)；但低濃度組與+10Gz 組相比，Bax、Bcl-2 表達水平與+10Gz 組差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 嚼肌細胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表達 嚼肌細胞Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白表達詳見圖3 和表2。

圖3 大鼠咀嚼肌細胞內caspase-3 和Cytochrome C 的蛋白表達

表2 不同處理情況下大鼠咀嚼肌細胞內caspase-3 和Cytochrome C的表達(平均值±SD,n=6)

如圖3 和表2 所示，+10Gz 組同正常組相比，caspase-3 和細胞色素C 的表達水平顯著升高(P＜0.05)；黃芪注射液各濃度組的caspase-3 和細胞色素C 表達水平較+10Gz 組表達水平均有所降低，除低濃度組細胞色素C 表達水平與+10Gz 組相比差異無統計學意義外，其余差異均有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

3.討論

G 值是指飛機飛行時產生的由頭至腳方向的加速度，高+Gz 是指加速度大于7 G，持續性是指空中戰機動或特技飛行時連續兩個空中戰動作循環，持續6～15s[4]。在高+Gz 下可引起嚼肌損傷，組織變形移位，部分肌纖維扭曲、斷裂、橫紋消失[5]。因而探索如何減輕高正加速度對嚼肌的損傷是本實驗的目的所在。本實驗中大體標本嚼肌形態學顯示：+10Gz 組嚼肌肌內血管擴張，組織充血，部分肌纖維扭曲、橫紋消失，出現肌肉收縮帶，少量甚至出現個別肌纖維壞死溶解,細胞核向中央移位見“核串”，+10Gz 組的嚼肌的橫切面見部分肌纖維橫徑變小，纖維呈棱角形。+10Gz 組嚼肌組織學改變明顯較AM 各濃度組嚴重；AM 各濃度組隨著AM 濃度增高，嚼肌損傷表現逐漸減輕，+10Gz+HAM 組嚼肌形態改變最小，+10Gz+LAM 組嚼肌形態學改變最大。本實驗結果表明，高+Gz 暴露可致嚼肌損傷，高+Gz 暴露前應用AM 注射液具有保護作用，且與劑量相關。

目前中藥成為細胞損傷保護的研究點，黃芪(Astragalusmembranaceus,AM)是其中的一種，黃芪注射液是提取AM 的有效成分制成的水溶液，主要成分：AM 皂苷類、黃酮、氨基酸、多糖及微量元素，具有調節機體免疫功能，增強細胞代謝，強心降壓，改善血液循環及抗衰老等作用。AM 能有效地對抗腦、腎、腸等臟器缺血再灌注損傷，保護內皮細胞，降低中性粒細胞浸潤，減少細胞凋亡[5,6]。鑒于AM 具備的多種功效，本實驗探索性的嘗試用AM 保護高+Gz 值暴露對咀嚼肌的損傷，組織學觀察結果顯示，AM 具有一定保護作用，且與劑量有關。

細胞凋亡與凋亡相關基因和蛋白的表達有關[7]。在動物細胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡機制和細胞凋亡核心，其功能及作用越來越受到關注[8,9]而這一通路的激活又依賴線粒體膜電位的下降以及線粒體內的細胞色素C 釋放到胞質，觸發caspase的級聯反應，從而誘發細胞凋亡[10]。細胞色素C和Caspase-3 分別作為線粒體凋亡途徑的啟動和關鍵執行因子，在細胞凋亡中有著不可替代的地位，也是檢測線粒體途徑導致細胞凋亡的重要指標[11]。有研究表明[12,13]，Bcl-2 對線粒體外膜通道的穩定起重要作用。各種凋亡刺激信號可通過BH3-only 蛋白引起Bax 蛋白移位到線粒體外膜并多聚化，形成膜通道，從而使線粒體的許多功能發生致命性的改變，使原先位于線粒體內的參與細胞凋亡的相關活性物質釋放出來，如細胞色素C(Cytochrome C)等，進而激活Caspase-3 蛋白酶，啟動不可逆的細胞凋亡途徑。

我們在前期的實驗中發現，+10Gz 暴露大鼠咀嚼肌出現TUNEL 染色陽性細胞，且顯著增多(P＜0.01)，提示+10Gz 暴露可導致咀嚼肌細胞凋亡[14]。本實驗中應用RT-PCR 法及Westernblot 法檢測與細胞凋亡相關的Bcl-2mRNA、BaxmRNA及胞漿內的Caspase-3 和細胞色素C 蛋白的表達。結果表明，+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌細胞BaxmRNA 表達水平顯著升高，Bcl-2mRNA 表達水平顯著降低以及caspase-3 和細胞色素C 蛋白表達水平顯著升高；預先應用AM 可以抑制上述mRNA 和蛋白的異常表達，并且呈劑量依賴性。Bax 表達增高，有利于線粒體膜上形成通透性孔道，而Bcl-2 表達降低則進一步促進通透性孔道的形成，從而使細胞色素C 釋放、Caspase-3 活化，導致細胞凋亡。本實驗結果顯示+10Gz 暴露可致大鼠嚼肌細胞凋亡相關基因和蛋白表達發生改變，AM 的保護作用可能與抑制細胞凋亡相關基因和蛋白的異常表達有關。

戰機高正加速度可致嚼肌損傷、肌細胞凋亡，中藥黃芪可能通過抑制細胞凋亡相關基因和蛋白的異常表達，保護嚼肌免受+10Gz 暴露的傷害，且有濃度依賴性，隨著濃度的增加，保護作用增強，對飛行員的訓練及防護有指導性作用。但黃芪通過何種通路導致嚼肌細胞凋亡降低尚待進一步研究。