組蛋白乙酰化酶對牙周膜干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激活的調(diào)控研究*

薛 芃 胡 楠 白 陽 蔡 川 賈婷婷 張賢華

慢性牙周炎發(fā)病機制和發(fā)展過程復雜。在慢性牙周炎長期炎癥微環(huán)境下，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERs)激活，未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)相關(guān)因子持續(xù)高表達，正常來源牙周膜干細胞(healthy periodontal ligament stem cells，H-PDLSCs)成骨分化能力持續(xù)降低。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短期炎癥微環(huán)境可導致ERs 和UPR 一過性升高[1,2]。因而猜想，長期和短期炎癥微環(huán)境對ERs 和UPR 的激活作用不同，可能是在長期炎癥微環(huán)境使細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，HATs)可以在炎癥微環(huán)境影響下改變PDLSCs 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[3-5]；HATs 還可影響ERs 表達[6-8]和干細胞分化功能[9,10]。因此，本研究通過篩選HATs 在炎癥微環(huán)境來源的PDLSCs(periodontitis periodontal ligament stem cells，P-PDLSCs)中的表達，繼而深入探究通過HATs 影響PDLSCs 中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)性激活的可能作用機制。

1.材料和方法

1.1 主要儀器 YJ-875 型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；6 孔板、平底96 孔板、底面積為25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon，美國)；體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；透射電鏡(FEI，美國)；CFX96 實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo，美國)；紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國)。

1.2 主要實驗試劑 α-最低必需培養(yǎng)基(alphaminimum essential medium,α-MEM)、雙抗磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、L-谷氨酰胺、青霉素及鏈霉素(Gibco，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(Amresco，美國)；Ⅰ型膠原酶、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)；TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)；實時定量PCR 試劑盒及cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)。

1.3 樣本收集與細胞分離培養(yǎng) 人正常來源牙周膜干細胞(H-PDLSCs)：收集解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心口腔頜面外科門診30 至45 歲患者因正畸需要拔除、無齲的健康前磨牙或第三磨牙；人炎癥來源牙周膜干細胞(P-PDLSCs)：收集解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心口腔頜面外科門診30 至45 歲患者因牙周炎需要拔除的牙齒。本項研究時間為2018年1 月至2018 年12 月。研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署了知情同意書。牙齒拔除后用含雙抗(青、鏈霉素)的PBS 液反復沖洗，用銳利刀片剝離牙根表面的牙周膜組織，剪成1mm3小塊接種于6 孔培養(yǎng)板內(nèi)。每3 天換液1 次，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長達80%匯合即原代牙周膜細胞；取原代牙周膜細胞，調(diào)整細胞密度至10～15 個/ml 接種于96 孔板(每孔0.1ml)，37℃、CO2孵箱培養(yǎng)24h，標記單細胞孔后繼續(xù)培養(yǎng)；待形成克隆并達孔底面積1/3～1/2 時，胰酶消化，將多單克隆來源細胞懸液混合，體外擴增繼續(xù)培養(yǎng)。取第3 至5 代進行實驗。

1.4 實時定量PCR 檢測HATs 在P-PDLSCs中表達 經(jīng)上述方法傳代的第4 代P-PDLSC 消化、離心收集后，將細胞密度調(diào)整至2×105個/ml，接種至6 孔板，24h 后終止培養(yǎng)；采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，測定RNA 樣品濃度(A260/A280≥1.8)；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，觀察HATs 相關(guān)基因的表達情況，PCR 引物序列見表1。本項研究所用引物序列由Primer Premier 5.0 設計，上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。取1.0μl 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 在10μl 反應體系中進行實時PCR擴增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt(ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-GAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照，Ct 為循環(huán)次數(shù))法檢測各基因mRNA 相對表達量。每例樣品及陰性對照均設3 個平行復孔，取均值。

1.5 小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)的轉(zhuǎn)染

1.5.1 轉(zhuǎn)染方法 5μl Lipofectamine 2000 溶于250μl 無血清無雙抗α-MEM 培養(yǎng)液制成A 液，室溫孵育5min；5μl siRNA 溶于250μl 無血清無雙抗α-MEM 培養(yǎng)液制成B 液；將A 液和B 液混合，室溫放置20min。吸取細胞培養(yǎng)液，用無血清無雙抗α-MEM 培養(yǎng)液清洗細胞一次，將1000μl 無血清無雙抗α-MEM 培養(yǎng)液加入A 液和B 液的混合液，混勻后加入細胞培養(yǎng)板；轉(zhuǎn)染6h 后，倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，PBS 清洗，每孔加入細胞培養(yǎng)液2ml，繼續(xù)培養(yǎng)。

表1 本實驗所用實時定量PCR目的基因引物序列及長度

1.5.2 轉(zhuǎn)染效率檢測 轉(zhuǎn)染24h 后提取RNA，利用實時定量PCR 技術(shù)檢測siRNA 干擾效率在mRNA 水平的表達。每個轉(zhuǎn)染樣品設置三個復孔。

1.5.3 siKAT2A、siKAT3B、siKAT6A 和siKAT6B 后UPR 信號分子表達檢測 對H-PDLSCs進行siKAT2A、siKAT3B、siKAT6A 和siKAT6B轉(zhuǎn)染，以正常H-PDLSCs 為對照組。轉(zhuǎn)染24h 后提取RNA，利用實時定量PCR 技術(shù)檢測UPR 信號分子(PERK、IRE1、ATF6)mRNA 的相對表達量，PCR 引物序列見表1。

1.6 透射電鏡觀察siKAT6B 后H-PDLSCs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化H-PDLSCs 以2～3×107個/孔接種于六孔板24h 后，使用胰酶常規(guī)消化，800rpm 離心5min，棄上清，將PBS 沖洗后的樣品移入1.5 ml Ep 管，800rpm 離心5min，4℃固定12h，在室溫下進行脫水、滲透、聚合、切片，使用3%的醋酸鈾(30min)、枸櫞酸鉛(10min)雙染。透射電鏡觀察細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和大小，評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的變化。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 篩選4 個HATs 在P-PDLSCs 中的表達變化 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)PDLSCs 的鑒定見課題組之前已發(fā)表文章[1,11,12]。首先篩選了文獻報道與炎癥發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，同時與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)聯(lián)的HATs，見表2。結(jié)果顯示，與對照組比較，KAT2A、KAT3B、KAT6A 和KAT6B 4 個HATs在P-PDLSCs 中表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 低表達KAT6B 可以激活UPR 中PERK通路 成功證明KAT2A siRNA、KAT3B siRNA和KAT6A siRNA、KAT6B siRNA 沉默有效，表3。同時，KAT6B siRNA 可以引起UPR 中PERK 信號分子mRNA 相對表達量的升高，而對其他UPR信號分子表達無明顯作用；而其他三個HATs siRNA 的使用并沒有使UPR 信號分子mRNA 的表達量升高，表4。

表2 HATs 在P-PDLSCs mRNA 相對表達量()

表2 HATs 在P-PDLSCs mRNA 相對表達量()

注：對照組：正常來源牙周膜干細胞；P-PDLSCs：炎癥來源牙周膜干細胞；KAT1、KAT2A、KAT2B、KAT9 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Gcn5/PCAF 家族成員；KAT5、KAT6A、KAT6B、KAT7、KAT8 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST 家族成員；KAT3A、KAT3B 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP 家族成員；KAT4 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶TAF 家族成員；KAT12、KAT13B、GTF3C2 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶核受體共激活因子家族成員；a 表示與對照組相比P＜0.05。

表3 4 個HATs siRNA mRNA 相對表達量()

表3 4 個HATs siRNA mRNA 相對表達量()

注：對照組：正常來源牙周膜干細胞；KAT2A 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Gcn5/PCAF 家族成員；KAT3B 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP家族成員；KAT6A、KAT6B 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST 家族成員；a 表示與對照組相比P＜0.05。

2.3 低表達KAT6B 后H-PDLSCs 中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化 我們利用透射電鏡技術(shù)觀察在H-PDLSCs中使用KAT6B siRNA 后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，使用KAT6B siRNA 后，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔呈現(xiàn)異常擴張和腫脹，且粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體數(shù)量降低，圖1。

表4 4 個HATs siRNA 對UPR關(guān)鍵信號分子作用mRNA 相對表達量()

表4 4 個HATs siRNA 對UPR關(guān)鍵信號分子作用mRNA 相對表達量()

注：對照組：正常來源牙周膜干細胞；KAT2A 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Gcn5/PCAF 家族成員；KAT3B 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP家族成員；KAT6A、KAT6B 為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST 家族成員；PERK 為蛋白激酶受體樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；IRE1 為肌醇需要酶1；ATF6 為活化轉(zhuǎn)錄因子6；a 表示與對照組相比P＜0.05。

圖1 正常牙周膜干細胞(H-PDLSCs)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的透射電鏡觀察

圖2 低表達KAT6B 后正常牙周膜干細胞(H-PDLSCs)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的透射電鏡觀察

3.討論

慢性牙周炎是以細菌感染為主的多因素進展性疾病，在其臨床表現(xiàn)中，以牙槽骨喪失最為嚴重[13]。近年來越來越多的研究表明，細胞在受到缺血、低糖、低氧和感染等外界刺激時，其蛋白折疊和降解等程序?qū)⑹艿礁蓴_，產(chǎn)生ERs，為了適應這種應激反應，細胞通過UPR 對細胞進行保護和調(diào)節(jié)。UPR是一個復雜和協(xié)調(diào)并存的細胞應答反應，它通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三種跨膜受體完成調(diào)控：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase receptor like ER kinase，PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)和肌醇需要酶1(Inositol requiring enzyme1，IRE1)、也稱作ERN1。細胞處于靜息狀態(tài)下，三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白與GRP78 穩(wěn)定結(jié)合，保持非活性狀態(tài)；細胞處于應激狀態(tài)下，非折疊蛋白積聚，三種跨膜蛋白與GRP78 的解離，產(chǎn)生UPR。因此，UPR 的目的是減少非折疊蛋白的積壓以及恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，使細胞正常存活[14]。如果應激不能有效緩解，這個保護性的信號通路就會轉(zhuǎn)向促凋亡反應。本課題組首次發(fā)現(xiàn)ERs 在炎癥來源的PDLSCs 中表達激活，且可通過UPR 的PERK 通路導致PDLSCs 成骨分化下降，證明炎癥微環(huán)境下ERs 的產(chǎn)生是調(diào)控干細胞成骨分化的重要原因[1,2]。但炎癥微環(huán)境下ERs 激活后如何持續(xù)影響炎癥的進程尚不清楚。

近年來越來越多研究表明，慢性牙周炎與表觀遺傳修飾有關(guān)。表觀遺傳主要包括DNA 甲基化、微小RNA(micro RNA,mi RNA)修飾、組蛋白乙酰化和長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lnc RNA)修飾等[15]。組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳修飾其中一種，當組蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響基因轉(zhuǎn)錄。目前表觀遺傳與牙周炎的發(fā)生在組蛋白乙酰化領(lǐng)域的研究較為表淺，因此，本實驗首先通過對比正常及牙周炎癥來源的PDLSCs 中HATs 的表達水平，發(fā)現(xiàn)與H-PDLSCs 相比，P-PDLSCs 中KAT2A、KAT3B、KAT6A 和KAT6B 四個基因表達出現(xiàn)顯著下降。此研究表明，HATs 與牙周炎發(fā)生發(fā)展具有明顯相關(guān)，炎癥微環(huán)境可以引起4 個HATs 的低表達。

為進一步明確篩選出的4 個低表達的HATs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活的關(guān)系，我們利用siRNA 分別對4 個HATs 進行抑制，同時檢測UPR 信號分子(PERK、IRE1、ATF6)mRNA 相對表達量。我們發(fā)現(xiàn)，只有低表達KAT6B 后可以導致PDLSCs中UPR 信號分子激活，而其他3 個HATs 低表達后，不能引起UPR 激活。同時，我們使用透射電鏡直觀觀察到siKAT6B 后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴張，作為ERs 和UPR 被激活的標志[16]。這些實驗結(jié)果顯示，KAT6B 在對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR 的激活中發(fā)揮了重要作用。

KAT6B 屬于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移家族中MYST 家族的成員，它結(jié)構(gòu)包括NEMM(N 端Enok)結(jié)構(gòu)域，1 段催化MYST 模塊，2 段串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)(Plant homeodomain，PHD)和1 段富含谷氨酸鹽/天冬氨酸鹽(Glutamate/aspartate-rich，ED)結(jié)構(gòu)域和富含絲/蛋氨酸(Serine/methionine，SM)結(jié)構(gòu)域[17-19]。KAT6B 的MYST 結(jié)構(gòu)域具有乙酰化活性，可以乙酰化組蛋白H3 的賴氨酸9 和14；KAT6B的C 端結(jié)構(gòu)域是富含SM 的酸性區(qū)域，它們存在潛在的轉(zhuǎn)錄激活活性，但對于這一區(qū)域的功能相應的報道較少。比如，KAT6B 與DNA 不直接結(jié)合，它們作為DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活因子的共調(diào)解因子存在[17]；還有研究表明，KAT6B 可以介導RUNX轉(zhuǎn)錄因子的激活[17,20,21]。

綜上所述，本項研究結(jié)果顯示，牙周炎癥微環(huán)境可以導致組蛋白乙酰化酶KAT6B 降低，同時導致ERs 和UPR 激活，但KAT6B 對UPR 持續(xù)激活的具體機制尚待深入研究。