十批產地杜仲丸HPLC指紋圖譜的化學成分群分析

（棗莊市立醫院，山東 棗莊 277100）

杜仲為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮[1]，全國多有栽培。續斷為川續斷科植物川續斷的干燥根[2]。杜仲、續斷在處方中常以藥對出現，具有補益肝腎，強筋健骨作用，而又獨立成方，等量配伍組成杜仲丸。現代藥理試驗證明杜仲、續斷有調節骨密度，抗骨質疏松等作用[1-3]。此外杜仲丸有一定的抗抑郁，抗骨質疏松作用[4-5]。前期工作表明，鹽炙與配伍可以影響杜仲丸的藥效部位[6]。本研究采用HPLC指紋圖譜技術[7-10]，對杜仲丸化學成分群進行分析。

1 儀器與試藥

Agilent1100安捷倫，松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、梔子苷對照品購自中國生物制品檢驗所，續斷皂苷Ⅵ由中國藥科大學提供、蘆丁對照品為實驗室自制，純度分別為98.5%。乙腈為色譜純。杜仲、續斷經山東中醫藥大學周鳳琴教授鑒定[6]。杜仲：洗凈，去栓皮，切絲0.5 cm。續斷：凈制，切段。見表1。

表1 杜仲、續斷組合表

2 方法與結果

2.1 色譜條件：色譜柱為phenomenex Cl8（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，流動相為乙腈0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫，0～60 min，乙腈從6%線性梯度至36%），流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，分析時間：70 min，進樣量：20 μL。

2.2 供試樣品的制備：稱取杜仲飲片剪成3 mm以下碎片，續斷粉碎，過2號篩，粉末等量混合，稱取2.00 g，置于250 mL燒瓶中，量取60%乙醇100 mL，浸泡1 h，回流3 h，雙層濾紙抽濾，于60 ℃減壓回收至無醇味，用石油醚萃取，至石油醚層無色，定容，過濾，取續濾液作為杜仲丸供試品溶液[11]。

2.3 對照品溶液的制備：稱取松脂醇二葡萄糖苷4.18 mg[12]，續斷皂苷Ⅵ5.03 mg[13-14]，綠原酸5.65 mg，蘆丁10.92 mg[15]，槲皮素3.89 mg[16]，梔子苷6.96 mg等對照品，分別置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，過濾。并各取適量溶液，混勻，作為對照品混合溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗：取杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項所述色譜條件，連續進樣6次。結果11個共有峰的保留時間RSD值＜0.5%，峰面積比值RSD值＜5%。提示精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗：取杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項所述色譜條件，在0、2、4、8、16、24 h依次進樣。結果11個共有峰的保留時間RSD值＜0.5%，峰面積比值的RSD值＜5%。提示24 h內杜仲丸供試液穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗：取杜仲丸樣品6份，平行制備杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項所述色譜條件進樣，結果11個共有峰的保留時間RSD＜0.5%，峰面積比值的RSD值＜5%。提示重復性較好。

2.5 樣品的測定：精密吸取杜仲丸供試液和對照品溶液各20 μL，按上述色譜條件進樣分析。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 共有峰的標定：10批杜仲丸供試品溶液指紋圖譜有11個共有峰。松脂醇二葡萄糖苷、續斷皂苷Ⅵ、綠原酸、蘆丁、梔子苷、槲皮素7種標準品溶液與杜仲丸供試品溶液藥材的HPLC指紋圖譜對比分析，在相同色譜條件下只有松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、皂苷續斷Ⅵ的保留時間與指紋圖譜中相應峰一致，且兩個峰的紫外吸收曲線是相同。選取6號峰為參照峰，其中杜仲丸的高效液相指紋圖譜相對保留時間穩定，但相對峰面積差異較大，1號峰RSD為1.06，2號峰RSD為1.03，4號峰RSD為1.19，8號峰RSD為1.23、11號峰RSD為1.15。結果見圖1、2，表2、3。

圖1 杜仲丸供試品高效液相指紋圖譜

圖2 對照品高效液相色譜

表2 杜仲丸供試品特征峰和對照品的保留時間

2.6.2 相似度評價：分別將10批杜仲丸供試品溶液所得數據導入中藥色譜指紋相似度評價系統（2004A版），以中位數為參數生成杜仲丸

3 討論

3.1 從指紋圖譜共有模式比較結果分析，十批杜仲丸供試品溶液都有11個特征峰，且不同產地相同工藝的杜仲丸的高效液相指紋圖譜相對保留時間穩定，但峰面積差異較大，可能由于產地、氣候、生長環境、生長年份造成的差異所致。其中對化學成分1號峰、2號峰、4號峰、8號峰、11號峰的含量影響較大。

3.2 杜仲生產于湖北、四川、貴州、云南等省，從指紋圖譜上看在指紋圖譜的共有模式。10批杜仲丸指紋譜圖的重疊圖見圖3，共有模式見圖4，計算各批杜仲丸供試品溶液的相似度，樣品1、2、4、7、9、10相似度高于0.8，樣品5、6相似度在0.5左右。樣品1、2、4、7、9、10的杜仲來自于云南、貴州、四川。而樣品5、6的杜仲來自于陜西。提示杜仲產區有一定的地域性，且同一地域的杜仲差異性小。結果見表4。這幾個地區的杜仲的化學成分群含量較高，而產于陜西的杜仲的化學成分含量較低，表明杜仲產區有一定的地域性。此外本實驗為進一步分析鹽炙和配伍對杜仲丸化學成分群的影響提供方法學研究。

圖3 10批杜仲丸供試品的HPLC指紋圖譜

圖4 10批杜仲丸供試品HPLC的共有模式

3.3 樣品8杜仲丸供試品的相似度為0.2，分析原因可能與杜仲藥材質量有關，其樹皮薄，橡膠絲少，彈性弱，容易拉斷。

表3 10批杜仲丸供試品共有峰的相對保留時間及峰面積

表4 杜仲丸供試品高效液相指紋圖譜相似度結果