MicroRNA-145在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌侵襲轉移的影響研究

張志強 鄭 爽 馬 怡 王梓瑛 王曉舟 赫麗杰

（遼寧省人民醫院（中國醫科大學人民醫院）腫瘤一科，遼寧 沈陽 110016）

隨著我國對婦科疾病的預防和控制越來越重視，加強對惡性婦科疾病的篩查和盡早治療。乳腺癌作為發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，在女性群體發生率較高，且全球發病率均較高，呈現逐漸上升趨勢，因此需加強對其的防范和有效治療[1-3]。根據臨床研究可知，乳腺癌轉移會導致患者死亡的主要原因，而在腫瘤發生發展中miR-145參與度較高，且其在一些腫瘤中具有抑癌基因作用，因此需加強對其的研究，以其為可靠方案提供契機[4-6]。為此，本次研究對miR-145在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌侵襲轉移的影響進行了探討，并選擇2016年7月至2018年7月遼寧省人民醫院確診的乳腺癌患者48例作為研究資料，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年7月至2018年7月遼寧省人民醫院確診的乳腺癌患者48例作為研究資料，均為女性，年齡在32～75歲，平均年齡為（51.05±3.16）歲，排除化療、免疫或放射等抗腫瘤治療患者?；颊呔獣员敬窝芯績热菁澳康模易栽负炇鹬橥鈺@得醫院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法：取術中癌組織及相應癌旁組織作為標本，經分離處理，置于液氮速凍后，置入-80 ℃冰箱內儲存，選擇美國Gibco公司生產的DMEM培養基（HEK293T各HBL-100）、RPMI1640培養基（MCF-7各MDA-MB-468），L15培養基（MDA-MB-231），McCOY'S5A培養基（SK-BR-3）等，選擇美國Bio-Rad公司生產CFX96實時熒光定量PCR儀進行檢測。先進行細胞培養，所有培養基中均加入10%胎牛血清（美國Gibco公司），1%雙抗，均置入37 ℃培養箱中，5%CO2。取1 μg總RNA與1 μL逆轉錄酶，3 μL逆轉錄引物混合后在15 μL反應體系中進行轉錄，取1.33 μL逆轉錄產物cDNA與TaqMan 1 μL引物混合，在15 μL反應體系中40個循環，將U6作為對照，檢測miR-145的表達。利用劃痕實驗進行細胞遷移能力檢測，將對數生長期的SK-BR-3細胞鋪板，當細胞達到50%～70%融合后，依據說明將pSIF-miR-145質粒與pSIF空白質粒轉染至細胞，48 h后，利用滅菌槍頭劃痕，再利用PBS洗滌，將劃下的細胞去除，選擇無血清培養基培養，間隔24 h取樣，采用Transwell檢測細胞侵襲能力，在顯微鏡下取5個視野計算細胞計數?？赡馨谢蝾A測可采用TargetScan、PicTar和miRanda數據庫分析，構建ANGPT2 3'UTA端片段，將結合位點突變掉（GGGGGGG）的片段，將pGl3作為對照組，pSIF空白質粒轉染至HEK293T細胞，24 h裂解細胞分析結果。提取RIPA裂解細胞蛋白并測定濃度，每孔50 μg，分離后，電轉移至PVDF膜，二抗孵育、洗滌，最后掃描結果。

1.3 統計學處理：利用統計學軟件IBM SPSS Statistics 19對進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料以百分數（%）表示，采用卡方檢驗，統計值有統計學差異為P＜0.05。

2 結果

2.1 乳腺癌組織及細胞中miR-145的表達：經實時FQ-PCR檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR-145的相對表達量分別為（49.85±21.02）、（185.04±42.64）；實時FQ-PCR檢測對數生長期乳癌細胞系的miR-145表達，MCF-7為（0.50±0.04）、MDA-MB-231（0.06±0.01）、MDA-MB-468（0.35±0.03）、SK-B-3（0.04±0.01），均偏低，呈現為低表達。

2.2 miR-145對乳腺癌侵襲轉移的影響：轉染pSIF-miR-145質粒48h后，SK-BR-3細胞miR-145的表達量與陰性對照相比增高了445.42倍；觀察圖1可發現，劃痕實驗24h后轉染pSIF-miR-145質粒細胞化和愈合速度較低，侵襲實驗顯示，轉染pSIF-miR-145質粒后穿過基質膠的平均細胞數為（132±45）個，對照組穿過基質膠的平均細胞數為（622±76）個。

圖1

2.3 MiR-145直接靶向ANGPT2及對ANGPT2蛋白表達的影響：經雙熒光報告基因分析，HEK293T細胞轉染pSIF-miR-145、pRL-TKANGPT2野生質粒后，熒光素酶的活性顯著降低；而共轉染了pSIFmiR-145、pRL-TK-ANGPT2-mut質粒后，細胞中熒光素酶活性無變化，即miR-145直接靶向ANGPT2。SK-BR-3中轉染pSIF-miR-145或空載質粒，檢測ANGPT2的表達，觀察圖2可知，ANGPT2蛋白較陰性對照組顯著下調，即認為miR-145對ANGPT2蛋白表達有抑制作用。

圖2

3 討 論

本次研究結果顯示經實時FQ-PC檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR-145的相對表達量分別為（49.85±21.02）、（185.04±42.64）；實時FQ-PCR檢測對數生長期乳癌細胞系的miR-145表達，MCF-7為（0.50±0.04）、MDA-MB-231（0.06±0.01）、MDA-MB-468（0.35±0.03）、SK-B-3（0.04±0.01），呈現為低表達。miR-145直接靶向ANGPT2，且ANGPT2蛋白較陰性對照組顯著下調，即認為miR-145對ANGPT2蛋白表達有抑制作用。根據相關研究可知，在人類復雜的基因調控網中，microRNA至關重要，而其通過其種子序列完全或部分與靶mRNA的3'UTR端互補配對，實現對目的基因的抑制[7-9]。當前認為miR-145在多種腫瘤中起到的是抑癌基因的作用，且本次研究結果證實，其對ANGPT2蛋白表達有抑制作用。腫瘤的生長和遠處轉移依賴血管的形成，ANGPT2作為血管生成素家族成員，促進腫瘤的侵襲轉移，其即促進腫瘤血管的新生，又阻礙血管的完整性[10]。此外ANGPT2能夠通過α5β1整合素/ILK-Akt-GSK-3β-Snail介導的信號通路來誘導乳腺癌細胞的轉移促進癌細胞的侵襲轉移，而且其作為miR-145的靶基因，能夠通過靶向抑制ANGPT2來參與乳腺癌轉移的過程。

綜上所述，miR-145在乳腺癌中的表達偏低，可通過靶向調控ANGPT2蛋白來抑制乳腺癌的侵襲轉移。