某地區(qū)四種高危型HPV病毒基因啟動子上游長控制區(qū)與E2區(qū)基因突變的分析

（江西省萍鄉(xiāng)市婦幼保健院生殖遺傳研究室，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

子宮頸癌是世界上惡性腫瘤中的第二大殺手，而高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的根本原因。HPV是一種小型雙鏈DNA病毒，病毒基因組含有近8000 bp堿基，由早期區(qū)（E）、晚期區(qū)（L）和長控制區(qū)（LCR）三部分組成，其中E區(qū)編碼E1-E7七種蛋白質。病毒在浸染細胞后，首先E 區(qū)DNA序列整合進入細胞DNA，在斷裂位點的整合導致HPV基因組中p97啟動子的失活[1]。正常情況下，啟動子p97能抑制HPV病毒表達E6和E7蛋白，這兩個蛋白不僅可以與細胞抑癌蛋白P53和PRb蛋白結合，干擾調節(jié)細胞生長和細胞凋亡的正常途徑，同時使HPV感染的上皮細胞具有更強的增殖優(yōu)勢[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)HPV病毒各個亞型都存在不同程度的變異，并且突變基因位點各有不同，所導致的HPV致病性也存在不同程度的差異。本研究旨在通過分析萍鄉(xiāng)地區(qū)四種高危型HPV感染者所攜帶病毒E2區(qū)和LCR區(qū)序列突變，以期發(fā)現(xiàn)該地區(qū)四種HPV的E2區(qū)和LCR區(qū)的變異情況，以及不同病變程度突變是否存在著差異。

1 資料與方法

選取2013年6月至2018年4月入萍鄉(xiāng)市婦幼保健院住院婦科病理明確診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的患者進行追蹤。納入標準：①經(jīng)病理明確診斷；②并有HPV16、18、52、58四種高危型中的一種病毒感染的患者；③擬定HPV16、18、52、58四種高危型的病例數(shù)分別為50例、26例、50例、50例。采集HPV16、18、52、58四種高危型病毒感染患者的宮頸脫落細胞，提取核酸后送廣州凱普生物科技有限公司進行測序，分析E2區(qū)及LCR區(qū)序列變化。

2 結果

將測序所得數(shù)據(jù)與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)：①宮頸上皮內(nèi)瘤變患者與宮頸癌患者所攜帶的HPV16型在E2區(qū)分別有128個和73個突變點，在非編碼區(qū)LCR區(qū)均未發(fā)現(xiàn)突變點。②宮頸上皮內(nèi)瘤變患者與宮頸癌患者所攜帶的HPV18型在在E2區(qū)分別有0和12個突變點，在非編碼區(qū)LCR區(qū)的突變點分別為6個和163個。③宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌患者所攜帶的HPV52型在E2區(qū)分別有116個和40個突變點，在非編碼區(qū)LCR區(qū)分別為68和10的突變點。④宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌患者所攜帶的HPV58型在E2區(qū)的突變點分別為298個和0個，在LCR非編碼區(qū)分別有51和0個突變點。所有的突變位點統(tǒng)計見表1。

統(tǒng)計宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌患者中四種型別HPV在E2區(qū)和LCR區(qū)出現(xiàn)3次以上的突變位點，見表2。結果顯示，在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌患者中HPV16型感染中E2區(qū)3266delA和274insT發(fā)生頻率較高，沒有顯著性差異；HPV52型LCR區(qū)中7882delA突變位點在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌患者中存在顯著性差異；HPV58型E2區(qū)和LCR區(qū)中3284delA、3262delA和7734delC突變位點在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中發(fā)生率較高，而在宮頸癌患者中未見突變。

表1 宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中四種型別HPV的E2區(qū)和LCR區(qū)域突變數(shù)

表2 宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中HPV的E2區(qū)和LCR區(qū)域突變分布情況[n（%）]

從表1、表2數(shù)據(jù)可初步得出以下結果：①HPV16和HPV52型人乳頭瘤病毒E2區(qū)的基因突變數(shù)目在宮頸上皮內(nèi)瘤變中要明顯多于宮頸癌，這表明宮頸上皮內(nèi)瘤變與E2區(qū)的改變有較強的相關性。②HPV18型在萍鄉(xiāng)地區(qū)感染病例數(shù)較少，且該型別突變位點主要在LCR區(qū)，呈散在分布，提示萍鄉(xiāng)地區(qū)的HPV18型所致宮頸癌病變可能與LCR改變相關；③HPV58型的突變點主要分布在E2區(qū)并以3284delA、3262delA、7734delC為主，提示HPV58型E2區(qū)與宮頸內(nèi)瘤變相關；④HPV16型和HPV58型LCR區(qū)的保守性要遠高于E2區(qū)。

3 討 論

HPV病毒能夠依據(jù)具有高度保守性的L1基因進行分型，為臨床診療提供方向[5]。相比較L1基因的研究，HPV內(nèi)部其他區(qū)域的研究就相對匱乏，例如對病毒的整合及致癌性有重要作用的LCR序列和E2基因區(qū)。LCR是非編碼區(qū)，但卻是HPV中最重要也是最復雜的區(qū)域，它調控著E區(qū)和L區(qū)的表達。LCR由早期的啟動子、增強子和沉默子結構組成。如HPVl6型病毒E6/E7的表達直接受到HPV早期啟動子p97的控制，該啟動子又受到其他調節(jié)結構的調控[6-7]。

E2所表達的蛋白是HPV病毒E6/E7的轉錄阻遏物[8]，在HPV病毒基因組整合進人的基因組時會導致E2的編碼區(qū)受到破壞，從而解除了對E6/E7的轉錄抑制[9]。因此，E2的序列改變被認為在宮頸內(nèi)瘤變發(fā)展成宮頸癌的過程中發(fā)揮著重要的作用。

本課題通過對總樣本176例宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的患者的四種高危型HPV的E2基因和LCR序列進行分析，發(fā)現(xiàn)感染16、52、58型HPV的宮頸上皮內(nèi)瘤變患者體內(nèi)HPV病毒LCR區(qū)及E2區(qū)突變比例較在宮頸癌患者中的顯著性增加，而18型HPV LCR區(qū)和E2區(qū)突變比例在宮頸癌患者更高，且保守型高，提示不同高危型別HPV導致宮頸癌變進展的方式或不相同，HPV18型可能是因為LCR區(qū)的突變導致了E6/E7蛋白表達，從而加速了癌變的進展；16、52、58型HPV在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中突變比例較高，而在宮頸癌患者中較低，且存在較高突變頻率的突變位點，非散發(fā)型，這提示HPV16、52、58型多態(tài)性較高，某些高頻的突變位點可能是導致癌變進展的重要因素，這些高頻突變位點還有待進一步通過實驗進行驗證。萍鄉(xiāng)地區(qū)不同高危型HPV的E2基因和LCR序列差異分析將有助于我們更好地研究本地區(qū)的HPV病毒及其防治，為臨床治療和預防提供幫助。