禽白血病的檢測與診斷

徐麗　田宇杰　岑永秀　黃飛

禽白血病（AvianLeucosis）是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）和禽肉瘤病毒（AvianSarcomaVirus，ASV）群中的病毒感染引的多種腫瘤性疾病的統稱。該病毒能夠引起許多種具有傳染性的良性和惡性腫瘤。根據臨床癥狀可分為淋巴細胞性白血病（LLV）、成髓細胞白血病（AMV）、成紅細胞性白血病（AEV）、髓細胞樣白血病、結締組織腫瘤和骨硬化病等。大多數禽白血病引起的腫瘤與造血系統有關，少數損傷其他組織。

1.ALV的臨床癥狀

ALV感染的雞群產生的臨床癥狀和病理變化多種多樣的，從生長遲緩、產蛋率下降、免疫抑制等亞臨床表現，直至典型的腫瘤發生和死亡。感染雞的表現與毒株、感染年齡及雞的遺傳性等密切相關。在實際病例中內臟腫瘤、體表皮膚血管瘤或其它組織的腫瘤較少，更多的病例表現為生產性能下降和免疫抑制導致的免疫失敗。實際上，這種亞臨床作用帶來的經濟損失可能大于病例的腫瘤性死亡帶來的損失。

具有典型癥狀的發病雞被剖檢后，可見其內臟器官肝、脾、腎等有不同程度的腫大現象，且器官表面常出現灰白色的腫瘤結節。通過病理學觀察，其他組織，如肺臟、心肌間質、卵巢基質等部位常常會彌散分布有腫瘤細胞，腺胃壁及法氏囊間隙偶爾會伴有髓樣細胞瘤的出現。患病嚴重者，其組織便會縮小或消失。

2.ALV的檢測與診斷

通過臨床癥狀和剖檢變化對ALV感染的進行初步診斷，對疑似病例可以通過腫瘤的鑒定和組織病理學檢查初步診斷，然而馬立克氏病和淋巴細胞白血病這兩種最常見的淋巴腫瘤性疾病很容易混淆，并且大部分感染雞僅有部分亞臨床癥狀，此外，REV有時也會導致雞產生淋巴細胞性腫瘤，使ALV的鑒別診斷更加困難。因此，需要通過病毒的分離鑒定、血清學檢測方法和分子生物學檢測等方法進一步確診。

（1）病毒的分離鑒定

禽白血病毒既可以在雞胚成纖維細胞上培養，也可以在DF-1細胞上培養。用DF-1細胞時只有外源性ALV生長，而用CEF細胞可能有內源性ALV的假陽性，鑒定需用群特異性抗體做IFA或通過測序劃分亞群。病毒分離鑒定的優點是特異性高，可分離和保存流行株以進一步做致病性試驗。其缺點是技術要求高，成本高，周期長。

（2）血清學檢驗

①簡介免疫熒光（IFA）

該方法用于確定雞或雞群是否被外源性ALV-A/B或ALV-J感染過，其優點是方法簡單、可大批量檢測，通常代表外源病毒感染;缺點是與當前感染狀態無直接關系，不能用于鑒別診斷。該方法主要用于流行病學調查或種雞群凈化狀態的判斷依據之一，常用于判定SPF雞群有無感染。

②酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

通過ELISA方法檢測雞群中ALV-J的抗原或抗體陽性率在生產上已成為主要的方法。用單克隆抗體建立的夾心ELISA具有很高的特異性。這種方法尤其適用于大批量樣品的檢測。用原核細胞高效表達的ALV-JJL-2株gp85基因產物為抗原建立了檢測抗體的間接ELISA方法，具有較高的特異性和敏感性，重復性和穩定性好。但由于不同地區ALV-J流行株gp85基因及其分子變異存在著不同的規律，因此該方法可能只適用于檢測地方流行株。如果gs抗原（P27）ELISA檢測呈陽性，則需進一步用ALV-J亞群抗血清作中和試驗，確定其是否為ALV-J亞群病毒，防止檢出的是樣品中的內源性病毒的gs抗原。如果是基于P27抗原的檢測，則最好多次隨機取樣進行檢測后才能鑒定，因為雞群被外源性病毒感染后，在一定時期內P27的陽性結果將急速上升，而存在內源性病毒的雞群P27陽性率相對保持穩定（通常維持在一個很低的百分點）。

ELISA操作簡便，特異性強，重復性好，耗時較短，作為一種有效的普查方法在臨床實際中應用較為廣泛，常用于定期對種禽群進行ALV檢測和凈化。但因為常能同時檢測出內源性的ALV，檢測結果中常有假陽性的出現。

{3}病毒中和試驗（NT）

一個亞群中的ALV只能被同亞群中的ALV抗體所中和，而不被其他亞群的特異性抗體所中和，因此用J亞群特異性抗體或抗血清可以鑒定ALV-J。利用ALV-J病毒中和試驗檢測雞群，可以在感染雞的血清中檢測到ALV-J的抗體。然而，NT試驗操作繁瑣，耗時費料，臨床診斷時很少應用，且該方法不易于規范化和制度化，故也不適合于進口雞群的檢測。

{4}瓊指擴散實驗（AGP）

20世紀80年代，哈爾濱獸醫研究所研究出用羽髓檢測ALV的瓊脂擴散實驗，適用于現場大面積應用，曾在中國的種雞凈化中發揮了巨大作用。但是瓊擴試驗的敏感性較差，并有一定的假陽性出現。

（3）核酸分子檢測方法

①PCR及RT-PCR

PCR可檢測出ALV-J前病毒DNA，包括來自血液、腫瘤組織、病毒感染的組織或細胞培養物的樣本。PCR方法的敏感性比ELISA方法高出5倍。PCR方法可以檢測出ELISA抗體陰性雞體內ALV-J，可能原因是雞體內缺乏可以用ELISA方法檢出的相應抗體。但PCR方法受到ALV-J的env基因序列和正常雞群中同源基因的干擾，另外還受到抗原變異性的困擾，這使得PCR的使用變得越來越復雜。由于ALV-J的多變性，至今還沒有找到一對引物可通過PCR檢出所有J亞群病毒通過RT-PCR可以檢測ALV病毒RNA。

②實時定量PCR

Kim等利用實時熒光探針RT-PCR對J亞群病毒RNA定量化，同時將其結果與（Qc）-RT-PCR、傳統定量法（TCID50）和抗原捕獲ELISA法進行了比較，發現實時熒光定量RT-PCR法特異性非常強，易于操作，重復性好。

③環介導等溫擴增技術

Zhang等以普通水浴鍋和3對特異性LAMP引物建立了一種ALV-J的LAMP檢測技術，其敏感性比普通PCR高10倍，陽性率要比PCR高。因其可以在1h左右完成試驗過程，所以具有快速的特點，同時操作簡便，無需昂貴設備，因此適用于臨床快速診斷。

（作者單位：561000貴州省安順市西秀區農業農村局動物疫病預防控制中心）