雄性Kunming-DY大鼠血尿酸水平的主要影響因素*

范 楠，段為鋼，云 宇△

（1.昆明醫科大學基礎醫學院藥理學系，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學云南省中醫藥學分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650500）

痛風及其他高尿酸血癥相關性疾病是現代社會的常見病和多發病，男性相較于女性易發和多發。其發病機制仍未完全清楚，但認為主要與體內嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄異常和嘌呤攝入過多有關[1-2]。研究發現，高尿酸血癥是痛風的基礎病癥，與高血壓、II型糖尿病、高血脂等疾病有著緊密聯系[3]，高尿酸血癥儼然已成為嚴重危害人類健康的“第四高”[4-5]。尿酸難溶于水，在尿酸酶缺失機體內易產生結晶沉淀，因此人類易發生高尿酸血癥甚至痛風。中醫藥在降低血尿酸，防治痛風方面顯示了諸多優勢[6-8]。為了更好地認識高尿酸血癥的發生發展過程，評價中醫藥的降尿酸效果，課題組前期以Sprague-Dawley（SD）大鼠為背景，先用CRISPR/Cas9技術敲除尿酸酶基因獲得雜合子（Uox+/-）大鼠，然后通過反復交配和篩選獲得純合子（Uox-/-）大鼠（尿酸酶缺失大鼠），命名為Kunming-DY大鼠[9-10]，其血尿酸水平與人接近。該大鼠已成功用于評價中成藥排毒養顏膠囊的降血尿酸作用[11]。本研究以野生型SD大鼠和Uox+/-大鼠為參照，探討尿酸酶缺失對Kunming-DY大鼠飲食和尿酸排泄的影響，飲食與尿酸排泄之間的內在規律，對大鼠一般健康狀態的影響，為認識尿酸酶缺失對人類飲食和尿酸排泄的影響提供參考，并為此大鼠作為評價藥物降尿酸作用的模型動物提供詳實的生命健康數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Kunming-DY大鼠（Uox-/-）按照前期報道方法自制[9]，53只，雄性尿酸酶缺失雜合子大鼠（Uox+/-）自制5只，雄性野生型SD大鼠（WT）自制6只，日齡均為45 d。飼養于SPF環境，溫度（22±2）℃，相對濕度 40%～60%，自由飲食。

1.2 試劑與儀器 磷鎢酸法尿酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所生產，貨號：C012-1-1）；TRIS堿（Scientific Research Special生產，貨號：0497-500）；全波長酶標儀（北京凱奧科技發展有限公司生產，型號：K6600-A）；電子天平（中國·凱豐集團有限公司生產，型號：KF-H2）。

1.3 動物處理 選取日齡45 d的雄性大鼠，稱重，斷尾取血約0.2 mL，3 000×g離心5 min分離血清用于血尿酸（SUA）、血肌酐（Cr）和血尿素氮（BUN）測定。然后將其放入代謝籠中，監測其24 h進食量、飲水量、尿液排泄量和糞便排泄量。進食指數為大鼠每100 g體質量的24 h進食量，同理計算其他指數如飲水指數、尿酸排泄指數等，以考慮體質量的干擾。

1.4 尿酸含量、血肌酐和血尿素氮測定 血尿酸（SUA）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）分別按照試劑盒說明書操作，然后用酶標儀測定其吸光度。

將收集到的24 h尿液混勻后用50 mmol/L TRIS堿溶液稀釋20倍，按試劑盒說明書檢測其尿酸含量。糞便則加入3份量（重量）100 mmol/L TRIS堿溶液于搖床上（100 r/min）進行混勻提取，10 000×g離心后取上清測定其中的尿酸含量。

2 結果

2.1 Kunming-DY大鼠的飲食、體質量變化 Kunming-DY大鼠（Uox-/-）第45天的進食量與野生型（WT）和雜合子（Uox+/-）大鼠無明顯差異（圖 1A），但 Kunming-DY大鼠的飲水量有增加趨勢，與雜合子相比有統計學差異（圖1B）。由于Kunming-DY大鼠的體質量增長較慢（圖1E），因此進食指數（圖1C）和飲水指數（圖 1D）明顯增加。

圖1 Kunming-DY大鼠的飲食、體質量變化

2.2 Kunming-DY大鼠的血清指標變化 Kunming-DY大鼠的血尿酸值明顯升高，接近男性成人水平，與前期報道一致[9]，同時雜合子大鼠的血尿酸水平也有增加趨勢（圖2A）。與野生型大鼠相比，Kunming-DY大鼠的BUN（圖2B）和Cr（圖2C）均顯著升高；提示Kunming-DY大鼠有一定程度的腎損傷，與前期報道一致[9]。

2.3 Kunming-DY大鼠尿液變化 Kunming-DY大鼠尿液中的尿酸含量增高（圖3A），24 h尿液排泄量明顯增加（圖3C、3D），因此24 h尿液尿酸排泄量也明顯增加（圖 3B、3E）。

圖3 Kunming-DY大鼠尿液中尿酸的變化

2.4 糞便 Kunming-DY大鼠糞便中的尿酸含量有增加趨勢，與雜合子相比顯著增加（圖4A）。24 h糞便排泄量也有增加趨勢，與雜合子相比也顯著增加（圖4C、4D）。因此，與雜合子相比，Kunming-DY大鼠24 h糞便尿酸排泄量也明顯增加；奇怪的是，與野生型相比，雜合子大鼠的24 h糞便排泄量是減少的（圖3B、3E）。

圖4 Kunming-DY大鼠糞便中尿酸的變化

2.5 Kunming-DY大鼠尿酸總排泄量變化 根據已有的認識，尿酸主要經腎排泄，占比2/3以上，腸道是尿酸排泄的次要途徑，占比不到1/3，兩者之和近似于尿酸的總排泄量。從本研究看，Kunming-DY大鼠24 h的總尿酸排泄量較Uox+/-大鼠和野生型大鼠明顯增加（圖5A、5B）。從總尿酸排泄中的尿液尿酸比來看，WT大鼠和Uox+/-大鼠的尿液尿酸排泄占3/4左右，Kunming-DY大鼠尿液尿酸排泄的占比增加到9/10左右（圖5C）。

圖5 Kunming-DY大鼠尿酸排泄總量變化

2.6 飲水和尿量關系分析 在24 h出入量分析中，Kunming-DY大鼠的飲水量和尿液量變化較大。動物的飲水一部分從呼吸中散發，一部分從皮膚蒸發，一部分則從糞便帶出，當然最主要的還是生成尿液。從尿量占飲水量的比值看，Kunming-DY大鼠增加的飲水主要是生成了尿液（圖6A），該占比與野生型大鼠相比具有統計學意義。從飲水尿液量差值看（圖6B），各組也有一定差異趨勢，但總體上均未見統計學差異。

圖6 Kunming-DY大鼠飲水和尿量關系分析

2.7 Kunming-DY大鼠各指標的相關性分析 將各指標進行兩兩相關性分析（表1）發現，SUA與進食指數負相關，與體質量也存在負相關；這意味著對Kunming-DY大鼠而言，尿酸的來源主要是內源性的，而不是由食物導致，在同齡條件下，體質量輕的大鼠血尿酸反而高。

表1 Kunming-DY大鼠各指標相關性分析

對于體質量因素來說，該因素除了與SUA負相關外，還與排尿指數、進食指數和飲水指數負相關，說明Kunming-DY大鼠的體質量越大，相對而言，飲食反而減少，導致排尿量也減少。然而，體質量與Cr的相關性較高，提示體質量的增加可能對腎功能不利。

需要說明的是，Cr與排尿量指數、尿液尿酸指數、糞便尿酸指數、總尿酸排泄指數呈負相關，和體質量與BUN呈正相關；BUN與糞便尿酸指數呈負相關，與血肌酐呈正相關。這說明排尿增多、尿酸排泄增多有利于腎功能，與傳統認識一致。

3 討論

Kunming-DY大鼠是課題組前期研制的一種尿酸酶缺失大鼠[9]。與文獻報道的尿酸酶缺失小鼠不同[12-13]，該大鼠可以長期存活，血尿酸水平沒有異常增高。Kunming-DY大鼠的血尿酸水平與同性別人群的血尿酸水平相似，用該大鼠尿酸變化規律推測人類尿酸變化規律具有較好的參考價值。

本研究中，尿酸酶缺失后，相同日齡的大鼠進食量變化不大，Kunming-DY大鼠與野生型和雜合子大鼠相比，體質量明顯偏輕，繼而導致進食指數明顯增加。Kunming-DY大鼠的SUA、Cr、BUN明顯升高，推測該大鼠由于尿酸酶缺失可能存在輕度的腎功能損傷。SUA升高，大鼠尿酸排泄代償機制增加[14]，即尿液尿酸和糞便尿酸同時在濃度（含量）和24 h排泄總量上均明顯增多，這支持腸道或腎臟途徑能代償性排泄尿酸的理論[5，15]。結果顯示，尿酸排泄增多最主要還是通過腎臟排泄途徑來實現，通過尿液和糞便排泄的尿酸近似于機體尿酸排泄的總量，Kunming-DY大鼠的尿液和糞便尿酸排泄之和也明顯增加。

有意思的是，在Kunming-DY大鼠各因素的相關性分析中可以看到，SUA與進食因素存在負相關。這似乎說明，機體內的尿酸主要來自內源性代謝，進食減少可能會使機體自身細胞更替加快反而導致SUA升高。進一步研究發現，Kunming-DY大鼠禁食36 h，血尿酸明顯升高，野生大鼠禁食后也可以觀察到該現象。比如，本研究中的野生型雄性大鼠SUA為（11.57±3.63）μg/mL，而禁食36 h但不禁飲的大鼠血尿酸可以升至（20.93±6.98）μg/mL[16]。此結果表明禁食或節食并不是降尿酸的有效措施。特別地，本研究還發現，SUA與體質量存在負相關，該現象與現有臨床觀察不符。該現象的出現，可能與本研究采用的均為45日齡大鼠有關，因為45日齡的Kunming-DY大鼠體質量約為200 g，遠小于Kunming-DY大鼠成年后的穩定體質量（約500 g）。在大鼠體質量上升期，體質量的增加說明同化作用大于異化作用，而內源性尿酸主要是異化作用過程中產生的[17]。

Kunming-DY大鼠生長減緩，飲食卻明顯增加，血尿酸水平明顯升高與人類血尿酸水平相似，存在輕度的腎功能損傷，這些結果表明尿酸酶缺失對大鼠的健康產生了負面影響。同時，Kunming-DY大鼠的血尿酸升高主要是內源性尿酸生成增多所致，尿液和糞便的尿酸排泄量會代償性增加。