基于網絡藥理學和分子對接技術探究柴胡-葛根治療肺炎支原體肺炎引起發熱的作用機制*

李艷嬌，李煥敏，孫 丹，韓耀巍，李新民△

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院/國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300380；2.天津中醫藥大學，天津 300160）

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一種兒童常見的社區獲得性肺炎。患兒臨床表現輕重不一，以發熱和咳嗽為主要臨床癥狀。MPP患兒中約44.4%可出現發熱，重癥MPP均伴有發熱癥狀，其中88.5%出現高熱（體溫≥39℃）[1]。及時退熱是改善患兒舒適度的重要治療措施，是評價MPP疾病療效的重要指標。MPP相關指南推薦以大環內酯類抗生素為主，對乙酰氨基酚、布洛芬等退熱藥為輔助的治療措施[2]，但部分患兒存在對藥物不耐受以及耐藥等情況，特別是布洛芬的胃腸道副作用，以及阿奇霉素的耐藥問題[3]，從而導致預后不良。

中醫的藥對是以兩味中藥為基礎的配伍單位，歷經多位醫家的臨床實踐傳承，體現了中醫辨證思想以及組方用藥規律。中藥藥對調節發熱的優勢不容小覷，具有多靶點多通路以及安全穩固的特點。網絡藥理學是基于藥學、計算機學、分子生物學等多學科理論基礎，運用生信分析手段探討藥物與疾病靶點之間的相互作用的重要方法。分子對接技術是運用計算機不同的算法對分子間的親和力進行幾何匹配和能量匹配的過程。分子對接和網絡藥理學作為計算機輔助醫藥領域的2項重要技術，為中醫藥在實現研究方法嚴謹規范、研究深度微觀具體，研究范圍醫藥精準對接方面提供了有力的支持。

本研究以天津名中醫李新民教授治療MPP發熱患兒的常用藥對柴胡-葛根為物質基礎，運用網絡藥理學和分子對接的技術手段，從中醫的整體辨證角度分析藥物成分靶點的微觀作用機理，探討柴胡-葛根治療MPP發熱癥狀的作用機理。

1 材料與方法

1.1 柴胡-葛根相關靶點篩選 TCMTS（Https：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一個獨特的中草藥相關藥理學平臺，載有藥物、靶標和疾病之間的關系。利用TCMTS平臺查找2味中藥的活性成分，活性成分初篩標準設置為口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，且類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18，后查找文獻進行補充。編輯整理中藥活性成分對應的靶點信息。

利用Uniprot（Https：//www.uniprot.org/）篩選“Homo sapiens”“Reviewed”的所有蛋白質靶點。與上述獲得的中藥活性成分靶點匹配，再進一步整理，即為柴胡-葛根活性成分相關靶點信息，導入Cytoscape3.7.2中構建網絡互作圖。

1.2 引起疾病MPP和發熱癥狀的相關靶點篩選 以“Mycoplasma pneumoniae pneumonia”和“fever”為關鍵詞，挖掘 GeneCards數據庫（Https：//www.genecards.org）、OMIM 數據庫（Http：//www.omim.org）中引起MPP發熱的作用機理。GeneCards數據庫的選取標準為score大于中位數。合并2個數據庫疾病靶點，刪除重復項，即為引起疾病MPP和發熱癥狀的相關靶點。

1.3 柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀靶點PPI網絡為探究柴胡-葛根藥物相關靶點與MPP發熱間的相互作用，利用Bioinformatics&Evolutionary Genomics（Http：//bioinformatics.psb.ugent.be/）繪制韋恩圖。獲取的交集基因導入 STING（Https：//string-db.org）數據庫構建PPI網絡圖，網絡構建標準設置為“Homo sapiens”“Highest confidence ＞ 0.9”，其余為默認值。結果保存并導入Cytoscape3.7.2中，利用MCODE插件，設置參數為 Degree Cutoff：5，K-core：5，其余設置不變，篩選潛在蛋白質功能模塊和相對應的關鍵靶點信息。

1.4 柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀功能、通路富集 將上述過程得到的柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀關鍵靶點信息導入Metascape（Https：//metascape.org/），選擇“Homo sapiens”，“P＜0.01”，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析。利用ImageGP（Http：//www.ehbio.com/ImageGP/）進行數據可視化分析。

1.5 柴胡-葛根成分—MPP發熱癥狀靶點—通絡網絡圖的構建 把柴胡-葛根成分、交集關鍵靶點和KEGG通路導入Cytoscape3.7.2中構建柴胡-葛根成分—MPP發熱癥狀靶點—通路網絡圖，并分析連接度（Degree）、介度（Betweenness）以及緊密度（Closenesss）等網絡拓撲參數。導出網絡圖及表格，分析主要活性成分及主要關鍵靶點通路。

1.6 分子對接驗證 分析得到柴胡-葛根成分—MPP發熱癥狀靶點網絡圖中度值排名前3的靶點，登錄RCSB PDB（Https：//www.rcsb.org/），設置“Homo sapiens”“Refinement resilution（A）1.5-3”結合文獻研究及3D構象選取這3個靶點的PDB ID。利用Pub－Chem（Https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找柴胡-葛根活性成分的2D結構，再導入Chemoffice中構建活性成分的3D結構。然后利用autodocktools1.5.6進行分子對接，所有對接結果用ImageGP平臺進行可視化分析。最后利用Pymolwin繪制主要中藥活性成分與關鍵靶點分子對接示意圖。

2 結果

2.1 獲取柴胡-葛根活性成分 初步提取柴胡化學成分349種，葛根成分18種，經過OB、DL篩選后獲得柴胡13種，葛根4種活性成分，包括槲皮素、山奈酚等，詳見表1。柴胡作用靶點336個，葛根136個，去掉重復靶點，一共獲得205個靶點，詳見圖1。

圖1 柴胡-葛根成分靶點網絡圖

表1 柴胡-葛根主要活性成分及靶點信息

2.2 引起疾病MPP和發熱癥狀的相關靶點篩選 從Genecards數據庫獲得MPP靶點314個，發熱靶點7 390個，根據Score大于中位數的目標靶點篩選潛在靶點，再結合OMIM進行補充，刪除重復項，最終獲得MPP發熱靶點1 057個。

2.3 柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀靶點PPI網絡將篩選的柴胡-葛根活性成分靶點與MPP發熱癥狀靶點取交集，并利用Bioinformatics&Evolutionary Genomics繪制韋恩圖，見圖2，得到疾病與藥物的共同靶點39個。再將靶點導入STRING，構建柴胡-葛根靶點PPI網絡，見圖3。

圖2 柴胡-葛根與MPP發熱癥狀韋恩圖

圖3 柴胡-葛根與MPP發熱癥狀靶點PPI網絡

PPI復雜網絡中存在部分密度較高的區域稱為module，module被認為是一種功能模塊，高度富集同一功能集團的蛋白質。在獲得柴胡-葛根與MPP發熱癥狀靶點PPI網絡后，導入Cytoscape3.7.2的MCODE插件中，設置參數，獲得內在13個核心靶點組成的module，見圖4。進一步利用 Network Analyzer計算分析了上述13個核心靶點的度值，見表2。據表所示核心靶點的度值相對較高，尤其是IL-6、TNF、IL-1β在網絡體系中有較高的作用。

圖4 柴胡-葛根與MPP發熱癥狀靶點PPI網絡中的module

表2 柴胡-葛根與MPP發熱癥狀核心靶點信息

2.4 柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀功能、通路富集 把柴胡-葛根成分與MPP發熱癥狀的13個核心靶點導入Metascape，整理結果，利用ImageGP平臺使數據可視化。根據圖5（A）所示，柴胡-葛根治療MPP發熱的主要生物過程包括細胞黏附的正向調節 （Positive regulation of cell adhesion）、JAK-STAT通路（JAK-STAT cascade）、對脂多糖的調節（Re－sponse to lipopolysaccharide）、白細胞的游動（Leukocyte migration）、上皮細胞的凋亡（Regulation of epithelial cell apoptotic process）、血管再生（Angiogenesis）、平滑肌細胞增殖（Regulation of smooth muscle cell proliferation）等。參與的通路包括細胞因子-細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、IL-17 調節通路（IL-17 signaling pathway）等，詳見圖 5（C），表 3。

圖5 柴胡-葛根主要成分潛在的富集靶點

表3 柴胡-葛根調節MP發熱癥狀的通路信息

相關靶點調節分子生物功能主要富集在細胞因子活性（Cytokine activity）、細胞因子受體結合（Cytokine receptor binding）、受體配體活性（Receptor ligand activity）、生長因子受體結合（Growth factor receptor binding）等，見圖 5（B）。

2.5 柴胡-葛根成分—MPP發熱癥狀靶點—通絡網絡圖的構建 運用CytoScape3.7.2構建柴胡-葛根與MPP發熱癥狀靶點-通路網絡，見圖6。利用Cytoscape的NetworkAnalyzer功能分析柴胡-葛根中藥成分的度值，發現主要為槲皮素，其次為山奈酚，兩者可能是干預與MPP發熱癥狀的最主要成分，詳見表4。

表4 柴胡-葛根網絡節點特征參數

圖6 柴胡-葛根成分—MPP發熱癥狀靶點—通絡網絡圖

2.6 分子對接驗證結果 分子對接結果顯示Docking Score絕對值大于等于7的有7個，大于等于5小于7的有30個，小于5且大于等于4.25的有8個，小于4.25的有6個，詳見圖7。Docking Score絕對值大于4.25表示活性成分與靶點間存在結合能力，大于5.0時表示結合活性較強，大于7時表示結合活性極強，結果表示Docking Score絕對值大于4.25者占總數88.24%，大于5的占72.55%，大部分靶點與成分的結合活性較好。中藥活性成分槲皮素、山奈酚、刺芒柄花素和β-谷甾醇與3個靶點的結合活性均較強。

圖7 分子對接結果熱圖

利用Pymolwin繪制槲皮素、山奈酚與IL-6、TNF、IL-1β的分子對接示意圖，如圖8。中藥主要活性成分與關鍵靶點的結合氫鍵距離均小于3.5A，符合要求。且大部分結合氫鍵距離小于3A，屬于較強氫鍵。

圖8 槲皮素、山奈酚與關鍵靶點對接結果示意圖

3 討論

發熱是呼吸道感染常見的癥狀，持續發熱，熱退復現是公認的兒童難治性肺炎支原體肺炎的臨床表現[4]。蔣星華等[5]對920例MPP感染患兒的臨床資料進行回顧性分析，結果顯示肺炎支原體感染出現發熱的患兒達70.98%，高熱的患兒占發熱病人總數70.90%。中藥復方治療MPP患兒的發熱癥狀具有優越的療效。課題組對266例風熱閉肺型MPP患兒進行回顧性研究，發現中藥組的退熱時間與西藥組的退熱時間有明顯的統計學差異，中藥組優于西藥組[6]。李天力等[7]在對中成藥小兒消積止咳口服液聯合阿奇霉素治療兒童MPP的Meta分析中發現，聯合口服中成藥能提高治療兒童MPP的臨床總體療效，包括退熱時間、咳嗽消失時間以及啰音消失時間，且具有較好的安全性。動物實驗顯示，中醫藥可能通過調節NF-κB通路、IL-17通路干預MPP小鼠模型，改善MPP小鼠的發熱、咳嗽癥狀[8-9]。

對MPP的臨床研究中發現中，閆慧敏教授[10]收集81例難治性MPP患兒臨床資料，認為急性高熱期及低熱起伏恢復期病位在肺脾，血瘀是貫穿難治性MPP的重要病理因素。宮文浩[11]對493例兒童MPP進行臨床數據挖掘，發現小兒MPP臨床辨證可采用溫病學郁熱辨證方法，分為衛分無形郁熱證、積滯熱結證、痰熱郁結證等6種郁熱類型?；谥嗅t臨床的辨證總結，課題組認為MPP的主要病機為肺氣閉郁、瘀血阻絡，治療MPP患兒急性發熱期，多采用宣肺清熱、化瘀通絡，在主方麻杏石甘湯的基礎上加減用藥，其中柴胡-葛根為常用退熱藥對。柴胡為傘形科植物，根據形態分為北柴胡、南柴胡?！侗窘洝费云淇舍t“寒熱邪氣”；《別錄》言其可“除傷寒心下煩熱”；《藥性論》言其可散“熱氣”；《醫學啟源》言其可“除虛勞煩熱，解散肌熱，去早晨潮熱”。葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根莖，《本經》言其主“身太熱”；《別錄》言其可“出汗”，療“壯熱”；《藥性論》言其“治時疾解熱”；《本草拾遺》言其可醫“身熱赤”。綜上可見，柴胡、葛根自古以來就被各位醫家作為治療發熱的常用藥。現代動物實驗表明大劑量的柴胡煎劑（5g生藥/kg）或醇浸膏（2.5g生藥/kg）對人工發熱的家兔有解熱作用。對用傷寒混合疫苗引起發熱之家兔，口服煎劑或浸劑（2g/kg），也有輕度的降溫作用[12]。日本產葛根浸劑對人工發熱家兔有明顯解熱作用，維持4～5h 之久[13]。

本研究通過網絡藥理學方法初步篩選出柴胡-葛根治療MPP發熱癥狀的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素、刺芒柄花素等。肺部炎癥是引起MPP發熱的最主要原因。槲皮素是一種不含碳水化合物的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、鎮痛的作用。對槲皮素的基礎研究表明，槲皮素對肺的氧化應激損傷有一定的保護作用[14]，對大鼠氣道炎癥和粘液生成有一定的抑制作用[15]。槲皮素還可以通過下調肺成纖維細胞的miR-221、抑制NF-κB和JNK途徑改善病原體來源的脂多糖引起的肺損傷[16]。槲皮素具體的抗肺部炎癥的機制，一方面可能是通是過阻斷NF-κB和AP-1信號通路抑制TNF-α誘導的血管內皮細胞凋亡和炎癥反應[17]，另一方面則可能是通過調節機體相關細胞因子的表達，改變病原菌的局部環境，進而抑制病原體的生長[18]。另外柴胡-葛根其他活性成分，如山奈酚亦可以通過MAPK和NF-κB途徑抑制病原菌引起的炎癥反應[19]。分子對接結果顯示槲皮素、山奈酚與主要靶點（IL-6、TNF、IL-1β）的結合活性較強，說明柴胡-葛根可能主要通過槲皮素、山奈酚調節MPP引起的發熱癥狀。

本研究表明，柴胡-葛根調節MPP發熱癥狀的靶點在IL-6、TNF。IL-6是一種在炎癥和B細胞成熟過程中起重要作用的細胞因子，其編碼的蛋白質是一種內源性致熱源，在免疫性疾病及感染性疾病中可以引起發熱。IL-6在急慢性炎癥部位產生，通過血液分布到全身，通過與IL-6受體α的作用，誘導炎癥相關因子轉錄。臨床數據顯現，IL-6明顯升高可能是MPP患兒的主要臨床特征[20-21]。通過對MPP患者中IL-6的單核苷酸多態性進行研究，發現IL-6 rs1800795與MPP的風險顯著相關[22]。進一步研究表明MPP的發病機制可能與觸發miR-1323/IL-6軸，爆發炎癥反應有關[23]。TNF是也一種內源性致熱源，是難治性肺炎支原體肺炎的預警指標[24]，其亞組分TNF-α是參與NF-κB信號通路參與MPP的炎癥過程的關鍵分子[25]。柴胡-葛根調節MPP發熱癥狀的通路主要涉及IL-17調節通絡（hsa04657）以及NF-κB信號通路（hsa04657）、Th17細胞分化（hsa04659）等。Th17細胞主要分泌的細胞因子為IL-17，Treg/Th17兩種細胞的失衡，是包括MPP在內的多種炎性及免疫性疾病的重要表現[26-27]。IL-17與MPP患兒的病情嚴重程度以及哮喘發作相關[28-29]。臨床資料顯示，兒童MPP患者外周血單核細胞中TLRs的表達存在異常改變且與NF-κB信號通路激活有關[30]。NF-κB通路的效應分子涉及IL-6、IL-1β，是本研究中分析得到的關鍵靶標。故推測柴胡-葛根調節MPP發熱癥狀的關鍵信號通路為IL-17信號通路和NF-κB信號通路。

本研究表明，柴胡-葛根的單一活性成分可以從不同的靶點調節MPP的發熱癥狀，而同一靶點又可以影響不同的生物細胞過程，體現了中醫中藥發揮作用的多層次，多靶點，多聯合性。單一靶點“牽一發而動全身”的調節方式，為中醫藥整體觀的辨證思想研究提供了科學依據，為后續進一步挖掘柴胡-葛根等中藥藥材開發擴寬了道路。但網絡藥理學是基于數據挖掘的一種研究手段，其本身就具有一定的局限性，再加上中藥材炮制方法、采集時間、采集品種等的差異性，給分析結果帶來了一定的不確定性。我們后期可以基于分析得到的關鍵靶點及通路，做進一步的實驗驗證，挖掘中藥治療MPP的深層機制。