天麻乙醇提取物輔助降血脂保健功能評價*

孫 航，代 蓉，寧 瓏，何芳雁

（云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500）

世界衛生組織2017年的數據顯示，2015年全球因心血管病死亡的人數約1 770萬，占全球死亡人數的31%，預計到2030年，因心血管病死亡的人數將會達到2 360萬[1-2]。我國國家心血管病中心發布的《中國心血管病報告2018》也指出，我國心血管病患病人數達2.9億，位于城鄉居民致死性疾病的首位，其農村、城市死亡率分別為45.50%、43.16%，且呈逐年上升趨勢[3]。高脂血癥是心血管病的主要誘因之一[4-5]，因此對高脂血癥人群進行早期干預以預防心血管事件的發生具有重要意義。

《本草綱目》記載：天麻，性味甘平，入肝經，有息風、定驚、肢益氣力、補五勞七傷通血脈的作用。天麻為云南道地藥材，2018年國家衛生健康委員會將其納入藥食同源目錄?，F有文獻報道，天麻細粉能有效調控糖脂代謝，具有顯著的降血脂作用，提示天麻在降血脂方面具有作為保健品開發的潛在價值[6-7]。由于天麻中含有大量淀粉，僅以天麻打粉后單用，或作為原料組成復方，可能會減弱天麻的藥效[8]。本實驗采用70%的食用乙醇提取，制備天麻提取物，參照2003年版《保健食品檢驗與評價技術規范》[9]，通過高脂飲食誘導復制大鼠高脂血癥模型，檢測血脂4項及肝組織病理損傷情況，以評價天麻提取物輔助降血脂的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠300只，清潔級，體質量（200±20）g，雌雄各半。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，批號43004700019312。適應性飼養3 d，飼養環境要求溫度18～24℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑 云南昭通彝良小草壩天麻，以70%食用乙醇提取的方法制備得到天麻提取物；辛伐他汀片（山東魯抗醫藥集團賽特有限公司，批號：20141204）；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所（批號分別為：20170726、20170809、20170718、20170819、20171007、20171124）；高脂飼料（77.8%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油+10%蛋黃粉+0.2%膽鹽）委托昆明市艾尼莫實驗動物養殖中心制作，生產許可證為SCXK（滇）K2012-0003。

酶標儀（Infinite M2000 PRO）；數顯恒溫水浴鍋（HH-S24）；分析天平（XS125A）；低溫高速離心機（cf16RXΠ）。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥劑量 參照2003年版《保健食品檢驗與評價技術規范》，做功能性篩選的動物實驗劑量一般不高于人體推薦量的2/3，不低于人體推薦量的1/3，且其中一個劑量應相當于人體推薦攝入量（折算為每公斤體重的劑量）的5倍（大鼠）或10倍（小鼠），且最高劑量不得超過人體推薦攝入量的30倍（特殊情況除外），受試樣品的功能實驗劑量必須在毒理學評價確定的安全劑量范圍內。故本實驗設置大鼠高劑量組為人體推薦量的25倍，即1.425 g生藥/kg（1 g提取物/kg），低劑量組為人體推薦量的5倍，即0.285 g生藥/kg（0.2 g 提取物/kg）。

1.3.2 動物分組及給藥 將大鼠隨機分為5組，即正常組（等體積蒸餾水）、模型組（等體積蒸餾水）、陽性藥（辛伐他汀，4 mg/kg）、天麻提取物高劑量組（天麻提取物，1 g/kg）、天麻低劑量組（天麻提取物，0.2 g/kg），各組動物以1 mL/100 g灌胃體積連續灌胃120 d，每天灌胃1次。除正常組外，其他各組均通過飼喂高脂飼料建立高脂血癥模型，連續飼養120 d，每隔30 d通過眼底靜脈叢取血1.5 mL，4 000 r/min離心10 min取血清，測定各組動物血脂4項（TG、TC、HDL-C、LDL-C）的含量，以評價高脂血癥模型復制情況，直至模型復制成功1周后處死動物進行指標檢測。

1.3.3 血脂4項及ALT、AST水平檢測 給藥前1 d將大鼠禁食12 h后，腹主動脈取血6 mL，靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液分別測定動物血脂四項及血清ALT、AST水平。充分研磨新鮮肝左葉用于制備10%肝勻漿，4 000 r/min離心10 min后，取上清液測肝勻漿中ALT、AST水平；肝右葉用于組織病理學觀察。

1.3.4 肝組織病理損傷情況 迅速剝離大鼠肝臟，在冰生理鹽水中沖洗后，濾紙上拭干水分，對其進行拍照，觀察各組大鼠肝臟外觀變化。分取右葉肝組織，將大鼠肝右葉置于4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱中固定過夜。次日取厚度不大于5 mm的組織塊放入鏤空鋁盒中，以流動水浸泡2 h以上。依次梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸泡石蠟。石蠟包埋固定，3 h后做連續切片，切片厚度為5 μm。將切片置于59～62℃烤箱內烘烤20 min，進行切片，常規脫蠟復水。復水后的組織經蘇木染色5 min，流動水沖洗15 min，鹽酸酒精分化后，流動水沖洗10 min，伊紅染色10 s，經梯度酒精脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 大鼠心肌及腎功能指標檢測 給藥前1 d將大鼠禁食12 h后，腹主動脈取血6 mL，靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液分別測定肌酐（Cr）含量和肌酸激酶（CK）水平。

2 結果

2.1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL-C水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組可降低大鼠血清中TC、LDL-C水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；天麻提取物高劑量組能降低大鼠血清中TC、LDL-C水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；天麻提取物低劑量組僅降低大鼠血清中LDL-C 水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清及肝臟ALT、AST水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），結合表1血脂四項結果，表明大鼠高脂血癥模型復制成功。與模型組比較，辛伐他汀組能降低大鼠血清中TC、LDL-C水平以及肝組織ALT、AST水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；天麻組均能降低肝組織中ALT、AST水平（P＜0.05）。天麻高劑量組能降低血清AST水平（P＜0.05），見表2。

表1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響（±s，n=15，mol·L-1）

表1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠血脂4項的影響（±s，n=15，mol·L-1）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）TCTGLDL-CHDL-C正常組 - 2.94±1.04 1.02±0.30 1.32±0.37 2.01±0.54模型組 - 4.95±2.90▲ 1.31±0.58 2.95±0.94▲ 1.80±0.56辛伐他汀組 0.004 3.99±1.48★ 1.02±0.48 1.58±0.87★ 1.24±0.45高劑量組 1 3.62±1.39★ 1.30±0.89 1.24±0.53★ 1.55±0.43低劑量組 0.2 5.21±2.64 1.31±0.82 1.76±0.68★ 1.29±0.46

表2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響（±s，n=15，U·L-1）

表2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝功能的影響（±s，n=15，U·L-1）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）肝臟ALT肝臟AST血清ALT血清AST正常組 - 42.93±33.75 21.88±6.36 4.53±3.22 10.55±3.07模型組 - 161.90±42.10▲ 44.44±23.48▲ 9.27±6.95▲ 21.42±11.32▲辛伐他汀組 0.004 68.32±35.28★ 37.55±20.49★ 9.55±7.81 18.10±9.88高劑量組 1 53.93±36.92★ 23.54±7.09★ 6.58±3.88 11.35±3.42★低劑量組 0.2 50.73±27.11★ 39.61±24.11★ 10.02±5.32 16.36±7.07

2.3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理損傷的影響

2.3.1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病變程度的影響 正常組大鼠肝臟大小正常，顏色暗紅，邊緣銳利，質地光滑柔軟；而模型組大鼠可見肝臟明顯腫大，顏色發黃，邊緣較鈍，表面飽滿光滑，切面有油膩感。天麻提取物高、低劑量組肝組織病變程度均較模型組有不同程度的改善，見圖1。

圖1 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病變程度的影響

2.3.2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理學變化的影響 正常組：肝組織結構整齊且完整，中央靜脈大小均一，中央靜脈周圍的肝細胞呈放射狀排列，細胞質豐富、均勻，細胞核中央排列。

模型組：肝組織結構呈不規則形狀，中央靜脈異常擴大，中央靜脈周圍存在脂肪空泡，細胞核偏向一側。這表明高脂飼料喂養已成功建立SD大鼠高脂血癥模型。

辛伐他汀組：肝組織結構基本整齊且完整，大多數中央靜脈大小均一，中央靜脈周圍的肝細胞呈放射狀排列，細胞質豐富、均勻，細胞核基本中央排列。

天麻提取物組：天麻提取物高劑量組肝組織結構呈不規則形狀，中央靜脈略微擴大，中央靜脈周圍存在少量脂肪空泡細胞，少量細胞核偏向一側；天麻提取物低劑量組肝組織結構呈不規則形狀，中央靜脈基本大小均一，中央靜脈周圍存在明顯脂肪空泡細胞，少量細胞核偏向一側，見圖2。

圖2 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理變化的影響（×200）

2.3.3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分評價 與正常組比較，模型組NAS積分升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和天麻提取物高劑量組NAS積分均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分的比較（±s，n=15，分）

表3 天麻提取物對高脂血癥模型大鼠肝組織病理切片NAS積分的比較（±s，n=15，分）

注：與正常組比，▲P＜0.05；與模型組比，★P＜0.05。

脂肪變（0～3） 小葉內炎癥（0～3） 氣球樣變（0～2）組別N A S積分0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2正常組 7 0 0 0 5 2 0 0 6 0 1 0.7 1±0.7 6模型組 0 0 1 5 3 0 2 1 0 2 4 5.6 7±1.6▲辛伐他汀組 2 0 2 3 6 1 0 0 6 0 1 3.8 6±1.2 1★高劑量組 0 4 1 2 5 2 0 0 0 1 6 3.8 6±0.9 0★低劑量組 0 1 1 4 5 1 0 0 0 1 5 4.5 0±0.8 4

3 討論

高脂血癥是指血液中TG、TC、LDL-C的含量過高，HDL-C含量過低的一種全身性脂代謝異常疾病[10]。高脂飲食可導致脂肪在肝細胞內堆積，使肝臟產生脂肪泡，形成脂肪肝，影響肝臟的脂質代謝，進而引起血脂水平升高[11-12]。天麻含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖、生物堿等多種復雜成分，具有鎮痛、鎮靜、降壓、免疫調節等多種藥理作用[13]。已有研究發現天麻細粉、天麻素及天麻酸性多糖可改善糖脂代謝紊亂，發揮降脂作用[14-17]。但天麻中含大量淀粉，僅靠打粉很難使其有效成分溶出，且成分單一，療效有限[8]。課題組前期參照2015版《中國藥典》“第三部通則0512技術要求”，對云南昭通3個產地（彝良小草壩、鎮雄鹽源、威信水田）的天麻，按藥典要求的質控成分進行含量測定。結果表明，彝良小草壩天麻的醇提率最高，且其藥典質控成分含量最高；另有文獻報道，采用70%乙醇進行提取，天麻提取物的得率最高，且天麻素提取更完全[18]。因此，本實驗采用70%的食用乙醇提取，制備彝良小草壩天麻提取物，符合保健品要求。

本研究通過喂養高脂飼料誘導SD大鼠建立高脂血癥模型，建模成功后在2003年版《保健食品檢驗與評價技術規范》“輔助降血脂功能功效學評價實驗的要求”的指導下，除檢查血脂四項及肝組織病變情況常用指標外，增加檢測血清、肝臟ALT、AST水平。ALT、AST主要存在于肝細胞中，是肝細胞損傷的敏感標志。當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增高，肝細胞內的ALT、AST釋放入血，血清ALT、AST水平急劇升高[19-21]，故檢測血中ALT、AST的含量或水平可快速判斷出肝功能是否正常。實驗結果顯示，天麻提取物高劑量組可顯著降低血清中TC、LDL-C及血清AST、肝臟ALT、AST的水平，并能顯著減輕肝損傷。根據以上指標綜合分析，天麻提取物具有輔助降血脂功能。

課題組前期開展了天麻藥材粉的毒理學評價（包括急性毒性實驗、遺傳毒性實驗、傳統致畸實驗、短期喂養實驗）均未發現受試物產生相關毒性，提示長期常規劑量下使用天麻提取物是安全的。

雖然模型組指標有明顯的變化，但部分指標不具有統計學意義。例如模型組大鼠血清中TG、HDL-C雖分別有升高及降低的趨勢，但無統計學意義。分析原因可能為本實驗周期較長，大鼠易產生厭食，導致模型組動物個體產生較大差異。其次，大鼠肝臟內LDL受體途徑對飲食中的固醇類具有抵抗力，可能導致其對高膽固醇食物不敏感[22]。大鼠還可通過減少自身肝臟合成膽固醇、增加膽汁酸生成等途徑來保持血漿脂蛋白穩定[22]。針對“厭食”情況已有文獻報道，可以采用高脂-普通飲食交替飼養的方法，但目前本課題組暫未進行具體結果的驗證，未來將對合理有效的建立高脂血癥模型進行深入研究。