腫瘤相關自身抗體對惡性肺結節的診斷價值

賈金芳 黃靜 朱曉莉

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一［1］。肺癌的平均5年生存率為17.4%，而IA期肺癌10年生存率達92%［2-3］，由此可見，早診早治是提高肺癌總體生存率的關鍵。早期肺癌多表現為肺結節，肺結節通常指影像學表現為直徑≤3 cm的局灶性、類圓形、密度增高的實性或亞實性肺部陰影，可分為孤立性和多發性病變，不伴肺不張、肺門淋巴結腫大和胸腔積液［4］。近年來，隨著低劑量螺旋計算機斷層掃描（low dose spiral computed tomography，LDCT）在肺癌篩查中的廣泛應用，外周肺結節的檢出率顯著提高，已達到93.8%，令肺癌死亡率降低20%。然而，LDCT存在假陽性率高（96.4%）和潛在的放射性損傷等問題［5-6］。

近年來腫瘤相關自身抗體（autoantibodies，AABs）在肺癌的相關研究中顯示出較好的診斷價值，已被部分歐美國家批準用于肺癌的早期診斷［7］。Zhang等［3］研究發現，p53、SOX2、GAGE7和MAGE-A1在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達明顯升高，PGP9.5 在肺鱗癌中表達較高，GBU4-5在肺腺癌中表達較高。Ren等［8］在中國高危人群中采用7-AABs（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE-A1和CAGE）和LDCT對早期肺癌進行篩查，結果顯示肺癌診斷的敏感性和特異性分別為61%和90%，7-AABs 和LDCT 結合顯著提高磨玻璃結節（ground glass nodule，GGN）和（或）實性結節（solid nodule，SN）診斷的準確率，具有一定的臨床應用前景。但目前關于腫瘤自身抗體在0～ⅠA期肺癌患者中的診斷價值少有文獻報道，本研究通過檢測肺結節患者血漿中AABs水平，探討自身抗體在惡性肺結節中的診斷價值。比較并分析7-AABs 與腫瘤標志物、Mayo 模型聯合檢測的診斷效能，并分析7-AABs陽性表達與CT征象的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月至2019年2月東南大學附屬中大醫院胸心外科和呼吸科收治的患者，所有患者均通過LDCT評估發現肺結節，并經手術取得病理診斷結果。收集術前臨床資料，包括CT征象、血液學檢查結果［（癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、細胞角蛋白19片段21-1（cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA 21-1）和AABs］、性別、年齡和吸煙史等，其中“無吸煙者”是指既往吸煙量少于100支的人。入選標準：1）胸部CT發現直徑≤30 mm的肺結節，包括純磨玻璃結節（pure GGN，pGGN）、混合磨玻璃結節（mixed GGN，mGGN）和SN；2）無肺癌病史；3）5年內無確診或治療的其他腫瘤病史；4）肺部未經任何放療、免疫治療或手術治療；5）無自身免疫性疾病史；6）無嚴重肝腎功能不全病史。本研究經東南大學中大醫院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 LDCT掃描參數及閱片 采用GE HD750 64排128層螺旋CT掃描機，螺距設定≤1，機架旋轉時間≤1.0 s，掃描矩陣設定不低于512×512；掃描參數為120kVp、30～50 mAs。根據Fleischner學會于2017年發布的肺結節大小測量建議，對SN和GGN在軸位、冠狀位及矢狀位選擇結節最大層面，根據結節大小取長軸和短軸平均值（＜10 mm）或分別記錄長軸和短軸（≥10 mm）。所有的患者胸部CT均采用連續薄層掃描（≤1.5 mm，常用1.0 mm或1.25 mm），常規重建連續冠狀位和（或）矢狀位，層厚1.0 mm。CT診斷由兩位有5年以上工作經驗的放射科醫生閱片，當意見不一致時經協商取得一致。

1.2.2 腫瘤相關自身抗體檢測方法 采取患者術前空腹外周靜脈血5 mL，2 000 r/min 離心15 min，分離血清，室溫（18～25℃）保存，并于8小時內通過ELISA法檢測血清樣品中的7 種自身抗體的濃度。試劑盒由杭州凱保羅生物科技有限公司提供，并由東南大學附屬中大醫院實驗室嚴格按照說明操作。用酶標儀在反應結束后30 min內讀取波長450 nm處的光密度值（OD450），并計算自身抗體的相對濃度。試劑盒中自身抗體參考范圍（U/mL）：p53＜13.1，PGP9.5＜11.1，SOX2＜10.3，GAGE7＜14.4，GBU4-5＜7.0，MAGEA1＜11.9，CAGE＜7.2。7 種自身抗體中的1 種或多種自身抗體的檢測結果高于其陽性判斷值時則診斷為“陽性”；所有自身抗體檢測結果均低于陽性判斷值水平則定義為“陰性”。

1.2.3 傳統腫瘤標志物檢測方法 由東南大學附屬中大醫院實驗室采用化學發光法檢測CEA、NSE 和CYFRA21-1。試劑盒中腫瘤標志物參考范圍（ng/mL）：CEA＜5.0，NSE＜16.3，CYFRA21-1＜3.3。

1.2.4 MAYO 模型 惡性腫瘤概率=ex/（1+ex），x=-6.827 2+（0.039 1×年齡）+（0.791 7×吸煙）+（1.338 8×惡性腫瘤）+（0.127 4×直徑）+（1.040 7×毛刺）+（0.783 8×位置）

公式說明：①e：自然系數；②年齡：患者年齡（年）；③吸煙：曾經/正在吸煙計為1，否則計為0；④惡性腫瘤：如患者有胸腔外惡性腫瘤史＞5年計為1，否則計為0；⑤直徑：結節的最大直徑（mm）；⑥毛刺：如結節邊緣有毛刺計為1，否則計為0；⑦位置：如結節位于肺上葉計為1，否則計為0。

1.3 統計分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。陽性樣本的數量和比例以二項式比例的95%置信區間（95% confidence interval，95%CI）表示。采用二元Logistic 回歸分析預測肺癌與研究指標間的關系。采用受試者工作特征（ROC）曲線，計算AUC值評估自身抗體、Mayo模型診斷惡性肺結節的效能。

2 結果

2.1 入組患者臨床特征

共納入208例肺結節患者，包括150例（72.1%）肺癌患者和58 例（27.9%）良性肺疾病患者。肺癌均為NSCLC，包括141例（94.0%）腺癌、7例（4.7%）鱗癌和2例（1.3%）大細胞癌，患者多數為女性（62.0%）和非吸煙者（64.7%）。肺癌組和良性肺疾病組的年齡差異具有統計學意義（P=0.007），在性別、吸煙史、結節大小和結節個數方面，差異均無統計學意義（均P＞0.05，表1）。

表1 患者的一般資料

2.2. 7-AABs在肺結節患者中的診斷價值

2.2.1 7-AABs 診斷惡性肺結節的敏感性、特異性和PPV 在所有患者中，單個自身抗體檢測的特異性較高（94.8%～100%），敏感性較低（8.7%～15.3%）。7種自身抗體聯合檢測敏感性提高至54.7%，優于單個自身抗體檢測（均P＜0.001）；7-AABs 的特異性和陽性預測值（positive predictive valve，PPV）分 別 為87.9%和92.1%，與單個自身抗體檢測相比，差異均無統計學意義（均P＞0.05，表2）。結合AUC 值，提示7種自身抗體聯合檢測的效能優于單一自身抗體檢測。值得注意的是，7-AABs 中2 個及以上自身抗體同為陽性時，其在肺癌診斷中的PPV（96.6%）高于單個自身抗體陽性時的PPV（90.0%，表2）。

2.2.2 7-AABs 在不同肺癌分期、結節大小和密度中的敏感性比較 為進一步研究7-AABs 在早期肺癌中的診斷價值，對肺癌組進行亞組分析。7-AABs 在0～ⅠA 期肺癌中的總體敏感性為54.5%（95% CI：46.3%～62.8%）。不同肺癌分期的敏感性見表3。

為評估7-AABs在不同結節大小中的診斷價值，對不同結節大小亞組（≤8 mm、9～20 mm和＞20 mm）間的陽性結果進行分析，結果顯示，7-AABs在亞組間的敏感性和PPV差異無統計學意義（均P＞0.05，表3）。同時，為評估7-AABs在不同肺結節密度中的診斷價值，對不同密度亞組（pGGN、mGGN和SN）間的陽性結果進行分析，結果顯示，7-AABs在不同密度亞組間的敏感性和PPV差異無統計學意義（均P＞0.05，表3）。

2.3 7-AABs與腫瘤標志物診斷價值的比較

7-AABs 與CEA、NSE、CYFRA21-1 及其組合比較，均顯示出更高的敏感性（均P＜0.05），特異性差異無統計學意義（均P＞0.05，表4）。7-AABs 與腫瘤標志物聯合檢測顯著提高肺癌的診斷能力，敏感性達70.0%（P＜0.05）。

2.4 7-AABs與Mayo模型聯合診斷肺癌的價值

為進一步提高診斷能力，將7AABs 與Mayo 模型聯合用于肺癌診斷。使用單陽規則將7-AABs 添加到Mayo模型中，即個體風險大于風險閾值或7-AABs中任一抗體陽性則判定為陽性。對于固定的風險閾值，例如設置Mayo模型的風險閾值為30%，當使用單陽性規則將7-AABs 添加到Mayo 模型中，相對于7-AABs、Mayo 模型，敏感性提高至68.7%（P1＜0.001），PPV提高至89.6%，AUC提高至0.699（表5）。

若使用雙陽規則將7-AABs 添加到Mayo 模型中，即個體風險大于風險閾值且7-AABs中任一抗體陽性則判定為陽性。對于固定的風險閾值（如30%），Mayo 模型和7-AABs 聯合檢測時，相對于7-AABs和Mayo模型，特異性提高至96.6%，PPV提高至94.1%，敏感性有所下降，為21.3%（表5）。

2.5 7-AABs與CT征象的相關性

在所有患者中，7-AABs陽性表達與短毛刺、空泡征具有相關性，結果具有統計學意義（P=0.032、P=0.017），與腫瘤外形、腫瘤邊界、分葉、支氣管充氣征、血管集束征、胸膜凹陷征、CT值均無相關性，差異無統計學意義（表6）。

表2 7-AABs與單個自身抗體的Sens、Spec和PPV比較

表3 7-AABs在不同肺癌分期、結節大小和密度中的敏感性和PPV比較

表4 7-AABs與腫瘤標志物的敏感性、特異性和PPV比較

表4 7-AABs與腫瘤標志物的敏感性、特異性和PPV比較（續表4）

表5 Mayo模型聯合7-AABs與Mayo模型、7-AABs的比較

表6 7-AABs陽性表達與CT征象的相關性

3 討論

在肺癌發展過程中，人體通過體液免疫應答產生針對腫瘤相關抗原的特異性自身抗體，血清AABs被認為是潛在的肺癌生物標志物［9］。Li 等［10］研究發現，在吸煙的慢性阻塞性肺疾病或石棉沉積癥患者被診斷為肺癌前已經可以檢測到p53。尚有研究表明，在肺癌患者的循環血液中，自身抗體能夠較CT提前5年發現腫瘤［11］。既往研究也提示多種自身抗體聯合測定可以有效檢測肺癌，尤其是在早期肺癌篩查中具有潛在價值［8，12］。但一些自身抗體也存在于其他疾病患者體內，尤其是自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風濕性關節炎、I型糖尿病和自身免疫性甲狀腺疾病等［13］。為排除以上疾病對AABs檢測的影響，本研究中所有患者在入組前均排除患有以上疾病。

在本研究納入的208例肺結節患者中，肺癌類型主要為周圍型腺癌（94.0%），且大多數是女性和非吸煙者，與肺腺癌的生物學特征一致。為了使肺癌組和良性肺疾病組之間的比較更為可靠，將肺癌組與良性肺疾病組受試者的性別、吸煙狀況、結節大小和結節個數進行匹配。遺憾的是，由于良性疾病組納入患者數量偏少，未能實現兩組的年齡匹配。

既往研究分析了7-AABs用于診斷肺癌的價值，顯示在Ⅰ～Ⅱ期NSCLC 中的敏感性為60%，特異性為91%［8］。本研究中，特異性和敏感性分別為87.9%和54.7%，與上述觀察結果相似。由于本研究中良性疾病組納入的人群數量較少，早期肺癌比例較高，因此敏感性和特異性稍低。本研究中，7-AABs 用于診斷肺癌的PPV 為92.1%，具有較好的診斷效能，當7-AABs中2個或以上自身抗體同時為陽性時準確性進一步提高。同時，7-AABs 在早期肺癌的不同分期中無顯著性差異，在肺癌的不同密度、結節大小和組織學亞型中，也保持著相對穩定的陽性檢出率。

一項研究顯示，7-AABs 較傳統腫瘤標志物CEA、NSE 和CYFRA 21-1 具有更高的敏感性［14］，與本研究結果一致，并且兩者聯合檢測可以顯著提高診斷的敏感性，有助于肺癌的早期診斷。

美國胸科醫師學會推薦將較為經典的風險預測模型（Mayo 模型）用于肺結節良惡性的判定［15］，該模型包括年齡、吸煙、腫瘤史、結節大小、有無毛刺及結節是否位于上葉6 個因素。由于該模型采用的影像學資料多來源于X線胸片，診斷的敏感性較低。為有效提高肺癌的診斷能力，本研究采用單陽規則將7-AABs添加到Mayo模型中，提高了肺癌診斷的敏感性和PPV，并保持著穩定的特異性，與Massion等［16］研究結果一致。采用雙陽規則聯合7-AABs 和Mayo 模型，提高了肺癌診斷的特異性和PPV，但敏感性有所下降。臨床醫生可以根據需要選擇單陽規則或雙陽規則將AABs加入Mayo模型，幫助早期識別高風險人群中的肺癌患者。

目前研究認為在肺癌的發展過程中，如原位腺癌向微浸潤性腺癌進展的中間階段，腫瘤細胞逐漸從附壁生長模式向浸潤性生長模式演變，結節邊緣可能出現分葉、毛刺或胸膜牽拉征，內部也有可能出現空泡征［17］。本研究通過分析肺結節患者CT征象發現，7-AABs 陽性表達與短毛刺、空泡征相關，或有利于良惡性肺結節的鑒別。與Meng等［18］的研究結果存在差異（抗體陽性表達僅與胸膜凹陷征相關），這可能與螺旋CT 掃描儀器及判讀專家的經驗誤差有關，也可能與納入人群的偏倚有關，因為本研究中所納入的所有人群均為住院患者，CT征象可能更具惡性腫瘤指向性。為排除上述因素的影響，后期可以采取多中心大樣本量進行分析和驗證。