水通道蛋白4在腸道病毒71引起的手足口病患兒口腔黏膜中的表達及臨床價值

肖青鋒，邴小三

手足口病是一種傳染性病毒性疾病，主要對象為嬰幼兒[1]。該疾病主要表現為發熱，手、足、臀部水皰疹，口腔黏膜潰瘍。手足口病的暴發主要由兩種腸道病毒引起：腸道病毒71和柯薩奇病毒A16。通常，手足口病是自限性的，但小部分兒童可能會經歷嚴重的并發癥，如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性麻痹和神經源性肺水腫[2-3]。因此，對手足口病的發病機制、診斷和治療的研究仍然具有重要的臨床意義。病毒侵入中樞神經系統可引起腦水腫和損傷，可進一步誘發交感神經興奮、兒茶酚胺釋放、全身炎性反應和免疫損傷，并最終導致神經源性肺水腫和其他嚴重并發癥。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是跨膜通道蛋白，能使水和其他小溶質（如甘油）在細胞間選擇性轉運[4]。已證實水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP-4）與腦水腫的發生和發展密切相關[5]。本研究旨在通過檢測兒童腸道病毒71相關手足口病患兒口腔黏膜中AQP-4的表達，為臨床判斷病情和預后提供幫 助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2016年1月－2019年1月襄陽市中心醫院收治的100例腸道病毒71引起的手足口病患兒為病例組，同期入院體檢的100例健康兒童為對照組。根據中國手足口病防治指南，對100例腸道病毒71引起的手足口病患兒進行臨床分期。

1.1.1 入組標準①符合診斷標準[6]的腸道病毒71引起的手足口病患兒；②年齡3～12歲，性別不限；③健康兒童無呼吸道疾病史；④健康兒童無手足口病接觸史；⑤臨床資料完整者。

1.1.2 排除標準①合并風疹者；②合并皰疹性咽峽炎者；③合并神經源性肺水腫者；④合并惡性腫瘤者。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測方法患兒入院后常規水銀體溫計檢測患兒體溫，電子血壓計測量血壓，治療前，從口腔處獲取口腔黏膜樣本，清晨空腹狀態下從肘關節處抽取靜脈血5 mL；治療7 d后，從口腔處獲取口腔黏膜樣本，空腹狀態下從肘關節處抽取靜脈血5 mL。健康兒童于入院后按照相同操作采集口腔黏膜樣本和血液樣本5 mL。所取得的口腔黏膜、血液樣本立即送往實驗室采用商業酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定C反應蛋白（CRP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、AQP-4和神經原特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）的水平，所有測定均按照ELISA說明書進行，所有樣品均一式兩份。檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標儀，AQP-4試劑盒購于中國武漢博士德生物工程有限公司，CRP、CK、CK-MB、NSE試劑盒購自美國R&D公司。

1.2.2 觀察指標①搜集兩組兒童性別、年齡等基線資料并進行比較；②比較兩組兒童血清CRP、CK、CK-MB表達水平；③比較兩組兒童血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平；④比較不同臨床分期患兒治療前基線資料；⑤比較不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平和NSE表達水平。

1.3 統計學處理

本研究中數據全部采用SPSS 20.0統計分析軟件（美國IBM公司）進行處理；計量資料采用“均數±標準差”表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率（%）表示，多組間比較采用χ2分析；P＜0.05為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 健康兒童與手足口病患兒基線資料比較

調查結果顯示，兩組兒童年齡、性別等基礎資料差異均無統計學意義（P＞ 0.05），病例組患兒平均病程（92.8±20.2）d，見表1。

2.2 健康兒童與手足口病患兒血清CRP、CK、CK-MB水平比較

病例組患兒血清CRP、CK、CK-MB水平均高于對照組，且兩組間差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1健康兒童與手足口病患兒基礎資料比較Table 1 Baseline data of the children with hand，foot，and mouth disease versus healthy children

表2健康兒童與手足口病患兒血清CRP、CK、CK-MB水平比較Table 2 Serum levels of C-reactive protein，creatine kinase，and creatine kinase isoenzyme in healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.3 健康兒童與手足口病患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平比較

病例組患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平均高于對照組，且兩組間差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3健康兒童與手足口病患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平比較Table 3 AQP-4 expression levels in serum and oral mucosa of healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.4 不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平比較

治療前，不同疾病分期患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平由低到高依次為臨床1期、2期、3期，差異具有統計學意義（P＜0.05）；治療后，不同疾病分期患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平均低于治療前相應各期，且由低到高依次為臨床1期、2期、3 期，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4不同臨床分期手足口病患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平比較Table 4 AQP-4 expression levels in oral mucosa of children with hand，foot，and mouth disease in terms of clinical stage before and after treatment

2.5 不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中NSE表達水平比較

治療前，不同臨床分期患兒口腔黏膜中NSE表達水平由低到高依次為臨床1期、2期、3期，差異具有統計學意義（P＜0.05）；治療后，不同臨床分期患兒口腔黏膜中NSE表達水平均低于治療前相應各期，且由低到高依次為臨床1期、2期、3 期，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中NSE表達 水平比較Table 5 Neuron-specific enolase expression levels in oral mucosa of children in terms of clinical stage of hand，foot，and mouth disease before and after treatment

3 討論

手足口病是一種常見的傳染病，主要感染10歲以下的兒童，主要臨床表現為發熱、手、腳、臀部水皰疹、口腔黏膜潰瘍。大多數癥狀是自限性和輕度的，潛伏期為3～6 d，早期癥狀是低熱、咳嗽和喉嚨痛，逐漸惡化為虛弱和食欲不振。在最初的癥狀之后，發疹開始時是帶有水皰的丘疹，最后變成潰瘍。病變通常發生在口腔內，包括頰黏膜、硬腭、面頰表面、牙齦和舌頭，而手掌和腳底，臀部和生殖器區域偶爾也會出現病變[7]。即使在手足口病期間臨床特征相似，某些特定方面也經常與特定病毒相關。在腸道病毒71引起的感染中，皮疹本質上是瘀點和/或丘疹，主要分布在軀干和四肢。手足口病可導致嚴重的并發癥，包括肌陣攣發作、震顫、眼球震顫、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣麻痹性疾病。在某些情況下，還觀察到心動過速、肺水腫/出血和心肺衰竭導致的立即死亡。手足口病目前還沒有有效的治療藥物或疫苗接種。因此，制定有效遏制手足口病的預防和治療措施已成為許多國家的研究重點。

AQP是一個新發現的膜通道蛋白家族。1994年，Agre和Verkman的研究小組獨立報告說，大腦表達了一種相當高量的AQP cDNA，這種AQP被稱為汞不敏感水通道，后改名為AQP-4，免疫定位于整個大腦的室管膜細胞和星形膠質細胞。迄今為止，在哺乳動物組織中發現了13種AQP，這些蛋白在調節跨細胞膜的水流中起著重要作用[8]。AQP功能失調是導致某些疾病的原因，這些疾病與水平衡失調或自身免疫有關[9-10]。目前，AQP作為治療學潛在的藥物靶點的相關性已被廣泛認可。免疫細胞化學顯示，AQP-4在鄰近腦微血管或腦表面皮亞爾覆蓋的星形細胞質膜區域特別豐富。AQP-4也包含在突觸周圍的星形細胞中，但水平要低得多，即星形膠質細胞不僅在解剖學上，而且在蛋白質表達方面，都是高度極化的細胞。AQP-4是中樞神經系統的主要AQP，就人體定位而言，AQP-4在星形膠質細胞和與血管或腦脊液密切接觸的不同組織中表達。AQP-4是大腦中最豐富的分子之一，在血-腦、腦脊液界面的星形細胞膜中尤為普遍。盡管AQP-4與許多病理生理過程有關，但它在大腦生理學中的作用仍不明確。近期有證據表明，AQP-4參與了細胞外空間容量調節、鉀緩沖、腦脊液循環、間質液吸收、廢物清除、神經炎癥、滲透感覺、細胞遷移和鈣信號傳導等多種功 能。

近年來，AQP-4作為一種新的有希望的治療靶點，引起了人們的極大關注。AQP-4在血-腦界面的高密度表達促使人們假設AQP-4控制著血-腦之間的水流量。哺乳動物大腦中最重要的AQP是AQP-4，其與大腦水腫和損傷密切相關[11-13]。國外研究團隊發現，在AQP-4基因敲除后，缺血后腦水腫大大減少；在中風大鼠中的研究發現，AQP-4的表達與腦水腫嚴重程度呈正相關，抑制AQP-4可有效緩解腦水腫；另有研究表明，外傷性腦損傷患者腦脊液中AQP-4水平顯著升高，AQP-4是評價外傷性腦水腫腦水代謝的靈敏的生化指標?，F已證實AQP-4與多種水平衡紊亂（即耳聾、腦水腫形成、癲癇和狼瘡性腦炎）有關[14-16]，在人類癲癇中，發現紅細胞膜透水性有缺陷；在肌萎縮側索硬化癥中，膠質細胞維持的腦內穩態的失敗被認為是神經細胞死亡的基礎，在肌萎縮側索硬化癥的大鼠模型中發現了AQP-4的上調；除了在腦內水轉運和離子穩態中的作用外，AQP-4還被證實影響包括β淀粉樣蛋白在內的腦實質蛋白的清除。這些新的研究支持AQP-4介導的水轉運強烈影響大腦中代謝物和離子的清除，不僅在腦內水平衡中起著重要作用，而且對腦實質分子清除也具有一定影響。腦功能不全是手足口病患兒嚴重并發癥的先決條件，為此提出假設AQP-4可能參與手足口病患兒腦水腫和損傷的病理過程。該病臨床2期是神經系統受累期；臨床3期是心肺功能衰竭前期，極大多數在5歲以下，尤其1～3歲兒童發病后易轉入臨床2、3期。本研究發現，腸道病毒71引起的手足口病患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平高于健康兒童，且AQP-4表達水平隨著疾病嚴重程度的增加而增加，治療后AQP-4表達水平降低，推斷AQP-4可能通過調控血-腦之間的水流量參與腸道病毒71引起的手足口病的發生、發展[17-18]。

綜上所述，口腔黏膜中AQP-4表達水平與腸道病毒71引起的手足口病發生、發展以及預后相關。本研究的不足之處是受試者中沒有3歲以下病例，該年齡段的病例收集工作將在后續研究中開 展。