敲除核因子E2相關因子對腎肌成纖維細胞活化與纖維化的影響

程水兵，郭洋洋，朱恒悅，肖言一，鄭士樟，戚如意，周俊雷，楊梅，白永恒

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江溫州325015，1．創傷外科；2．浙江省胰腺肝臟危重性疾病診治新技術研究重點實驗室；3.重癥醫學科）

腎間質纖維化是腎臟損傷逐步進展的結果，同時也是造成腎臟功能減退不可逆的原因之一。典型的腎纖維化發生機制為各種原因（缺血缺氧、氧化應激等）引起轉化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）等促纖維化因子的過度產生和釋放，誘導α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）陽性的肌成纖維細胞活化和積聚，最終導致大量的細胞外基質（如I型和III型膠原）成分在腎間質沉積所致[1]。然而，目前尚不十分清楚腎損傷過程中促纖維化因子如何被誘導產生，進而活化肌成纖維細胞。前期研究顯示，氧化應激重要的調節分子—核因子E2 相關因子（nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2，Nrf2）可能參與腎纖維化進程[2-3]。Nrf2 可以通過抗氧化和抑制炎癥反應，從而實現減輕腎損傷，保護腎小管間質纖維化作用[4]。本研究通過體內應用Nrf2 基因敲除小鼠構建單側輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）動物模型，觀察敲除Nrf2對腎肌成纖維細胞產生和間質纖維化的作用，及敲除Nrf2對TGF-β1分泌水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 Nrf2（又稱Nfe212）基因敲除小鼠（B6.129X1-Nfe212tm1ywk/J）購自南京大學南京生物醫藥研究院，動物許可證號：SCXK（蘇）2015-0001。野生型B6小鼠（C57BL/6）購自溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2019-0009。PAS染色試劑盒購自上海太陽生物技術公司；Masson試劑盒購自北京Solarbio公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋公司；兔抗α-SMA抗體（美國CST公司）；兔抗TGF-β1 和III型膠原抗體（美國Bioworld公司）；TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒，購自日本Toyobo公司；AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）；MyCycler梯度PCR儀（美國Bio-Rod公司）；7500Fast定量PCR儀（美國AppliedBiosystens公司）；VarioskanFlash全波長多功能掃描儀（美國ThermoScientific公司）；DM4000BLED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備：將實驗小鼠分成Nrf2野生型假手術組、Nrf2野生型UUO組、Nrf2敲除型假手術組、Nrf2敲除型UUO組4個小組，每組6只。UUO模型組進行左側輸尿管結扎，假手術組開腹后游離左側輸尿管不予結扎，于術后第7天取梗阻側腎組織用于指標檢測。UUO模型標準化關鍵在于無菌操作和結扎于輸尿管上1/3處。

1.2.2 生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平：取每只小鼠的外周血，1500r/min離心10min分離出血清，全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平。

1.2.3 PAS染色觀察腎組織病理變化：梗阻側腎取出后，進行縱軸和橫軸測量。橫截面切割切開后加入4%多聚甲醛固定，按常規方法進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成約4μm厚的切片，經脫蠟、梯度乙醇脫水，根據試劑盒說明書進行PAS染色，中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察腎組織切片，對腎小管間質損傷程度進行評分，評分標準參照文獻[5]。

1.2.4 Masson染色觀察腎組織纖維化：石蠟切片脫蠟后，按試劑盒說明書操作。蘇木素-三氯化鐵染核10min；鹽酸乙醇分化、水洗；氨水反藍，水洗；麗春紅酸性染液染色10min，醋酸洗1min；1%磷鉬酸作用2min，直接用苯胺藍染色2min；直接95%乙醇分化30s；脫水、透明、封片、鏡檢。Masson染色后肌纖維為紅色，膠原纖維呈藍色。評分標準參照文獻[5]。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測TGF-β1、α-SMA和III型膠原的表達：用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶法。標本用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續切片，厚4μm。枸櫞酸鹽微波輻射進行抗原修復，二氨基聯苯胺顯色后經蘇木精復染。以一抗稀釋液代替一抗作為陰性對照，細胞漿或胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達。光鏡下每張切片隨機選取10個高倍視野（×200），應用Image-ProPlus6.0軟件，計算每個視野下陽性表達區域的平均光密度值（累積光密度/分析面積）。

1.2.6 RT-qPCR檢測TGF-β1mRNA的表達：采用TRIzol試劑提取小鼠腎組織中的RNA，于260/280nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據試劑說明書將RNA反轉錄成cDNA。應用Primer5.0軟件設計小鼠TGF-β1mRNA的特異性引物，以β-actin作為內參，引物由上海生工公司合成，見表1。PCR擴增體系：5μL2×SYBRGreen熒光定量試劑、2μL引物（上、下游各1μL，終濃度200nmol/L）、2μL反應緩沖液、1μLcDNA。PCR程序為：95℃3min預變性，1 個循環；95℃5s，60℃35s，40 個循環。采用相對定量法計算獲得結果，溶解曲線分析結果的可靠性。相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=

表1 TGF-β1和內參β-actin的mRNA引物序列

1.3 統計學處理方法 采用GraphPadPrism7.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料用表示，多組間的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠腎功能比較 與Nrf2 野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組外周血清中血肌酐和尿素氮水平明顯升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。Nrf2敲除型UUO組血肌酐和尿素氮水平與Nrf2野生型UUO組比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 4組小鼠腎組織損傷程度比較 與Nrf2野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組腎小管擴張和間質面積擴大，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術組比，Nrf2敲除型UUO組腎小管擴張和間質面積擴大，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎小管擴張和間質面積擴大，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 4組小鼠腎功能比較

圖2 4組小鼠腎組織損傷程度比較

2.3 4組小鼠腎組織纖維化的比較 與Nrf2野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組腎間質總膠原累積顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術組比，Nrf2敲除型UUO組的膠原累積顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎膠原累積顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 4組小鼠腎組織纖維化的比較

2.4 4組小鼠腎組織肌成纖維細胞活化的比較 與Nrf2野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組腎組織α-SMA蛋白的表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Nrf2敲除型假手術組比，Nrf2敲除型UUO組α-SMA蛋白表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組α-SMA的表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 4組小鼠腎組織膠原累積水平比較 與Nrf2野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組III型膠原蛋白的表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P ＜0.01）。Nrf2敲除型假手術組比，Nrf2敲除型UUO組III型膠原蛋白表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組III型膠原蛋白的表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 4組小鼠腎組織TGF-β1表達水平比較 與Nrf2野生型假手術組比，Nrf2野生型UUO組TGF-β1mRNA和蛋白的表達水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2敲除型假手術組比，Nrf2敲除型UUO組TGF-β1表達水平明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除小鼠UUO組TGF-β1mRNA和蛋白的表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖4 4組小鼠腎組織肌成纖維細胞活化的比較

圖5 4組小鼠腎組織膠原累積水平比較

3 討論

核轉錄因子Nrf2 屬于帽和領（Cap'n'Collar，CNC）亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族（CNC-bZIP）成員，可通過編碼一系列抗氧化劑保護相關蛋白，調節多種細胞內氧化還原微環境，因此Nrf2成為細胞抗氧化應激的重要分子。多項研究表明，Nrf2與各種原因誘導的腎損傷及纖維化病變密切相關[2-4]。在鏈脲佐菌素誘發的糖尿病腎病中，Nrf2基因敲除會加劇小鼠腎損傷程度和纖維化[6]，而應用藥物靶向提高Nrf2活性，則能減輕慢性腎損害與纖維化程度[7]。因此，Nrf2可能是人類腎臟疾病潛在的治療靶點[8]。

本研究應用Nrf2基因敲除小鼠，通過構建UUO模型以形成纖維化，來研究Nrf2對腎肌成纖維細胞的活化與纖維化的影響。首先，本研究評價了敲除Nrf2對腎功能的影響，發現敲除Nrf2并未能明顯下調腎功能。推測這一方面可能與標本量有關，另一方面可能與對側腎的代償作用有關。其次，與Nrf2野生型UUO組比，Nrf2敲除型UUO組腎損傷更明顯，總膠原累積更嚴重。深入分析，Nrf2敲除型UUO組α-SMA的表達較Nrf2野生型UUO組更高，同時III型膠原的表達也明顯增強。這些證據表明：Nrf2與腎損傷及纖維化呈現明顯負相關。Nrf2可能通過抑制腎組織氧化應激反應，降低局部炎癥損傷，緩解腎肌成纖維細胞活化和膠原積聚[4]。同時，Nrf2也可能通過調控巨噬細胞浸潤和極化，抑制炎癥小體形成，最終影響腎纖維化進程[9]。基于此，Nrf2可以 預防或者減輕包括砷、鉻和鎘在內的多種重金屬引起的腎毒性[10-12]，也可以抑制免疫抑制劑環孢菌素A所致的TGF-β1表達增加，進而引起腎小管上皮細胞表型轉化和間質纖維化[13]。

圖6 4組小鼠腎組織TGF-β1表達水平比較

本研究也發現Nrf2 影響腎纖維化的機制與TGF-β1有關，TGF-β1是介導EMT最重要的誘導因子。對腎小管上皮細胞而言，TGF-β1可以通過細胞膜上受體TGF-β1R的介導，影響下游信號分子Smad2/3的磷酸化及入核表達，最終引起小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化[1]。同樣，TGF-β1的作用也可以促進腎間質成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并誘導肌成纖維細胞的活化。在肺纖維化模型中，敲減Nrf2可誘導TGF-β1介導的表型轉化和纖維化[14]。同樣，在糖尿病腎病中Nrf2 可抑制TGF-β1 轉錄水平，進而緩解纖維化病變[15]。Nrf2對TGF-β1轉錄水平的調控主要是通過與轉錄因子c-Jun和SP1 的相互作用，進而結合到TGF-β1啟動子的特定區域影響其轉錄[15]。本研究結果也支持了上述觀點，即Nrf2 對TGF-β1及肌成纖維細胞表型轉化的抑制作用。在構建的UUO模型中，腎TGF-β1mRNA和蛋白的表達均明顯升高，敲除Nrf2可加劇TGF-β1的表達。因此，TGF-β1可能是Nrf2抗腎纖維化作用重要的下游分子靶點。