不同外科手術取精時機對卵胞漿內單精子注射臨床結局的影響

潘承雙，張歡，徐芝慧，金建遠，費前進，倪吳花

（溫州醫科大學附屬第一醫院生殖醫學中心，浙江溫州325015）

隨著人類輔助生殖技術不斷創新和進步，特別是單精子卵胞漿內注射術（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）用于治療男性不育，配合外科附睪和睪丸取精術，使大部分既往需要通過供精或領養才有孩子的無精子癥男性不育患者有了成為生物學父親的機會。精子因素會對輔助生殖技術治療的結果產生負面影響。精子在通過男性生殖道時易受損傷[1]，一些研究表明，與男性因素不育癥患者（包括隱匿精子癥、畸形精子癥、重度少精子癥或嚴重弱精子癥患者）中的射精精子相比，使用睪丸精子具有更高的著床率、妊娠率和活產率[2-3]。對于精子DNA高損傷的試管嬰兒反復失敗患者，推薦使用睪丸精子而不是射精精子進行ICSI[4-5]，即使精液常規參數正常[6]。

外科手術取精依據部位可有附睪取精或睪丸取精。通常取精安排在取卵當天進行，如果找不到精子，可行供精治療。但當天睪丸活檢一般獲得的可注射的活動精子較少，收集足夠注射用的精子可能需要幾個小時。有研究表明睪丸精子體外培養可促進細胞分化及提高精子活動力，并可獲得與射精精子相當的受精率、著床率和妊娠率，建議睪丸活檢可以在取卵前一天進行[7]。然而，該類研究涉及例數少，且針對另一種外科取精方式（附睪活檢取精），在取卵前一天進行的附睪活檢取精的臨床應用和體外培養精子用于卵胞漿內單精子注射的臨床結局目前尚未見有報道。本研究探討外科取精（包括睪丸取精與附睪取精）次日行ICSI治療的可行性，并評價外科手術取精時間對ICSI臨床妊娠結局的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧分析2008年1月到2017年12月在溫州醫科大學附屬第一醫院就診行外科手術取精-ICSI治療的839例新鮮周期的臨床數據。納入標準：男方因無精子癥，不射精，勃起功能障礙等無法手淫獲取精液精子或精液精子活動力差采用外科取精-ICSI助孕的患者。所有入選周期排除了女性因素（卵巢儲備功能下降、獲卵數小于4、嚴重染色體異常等），以及由于各種原因如：卵巢過度刺激高風險、無胚胎移植、宮腔積液、患者主觀因素等未移植新鮮胚胎者。手術的時間是根據試管嬰兒實驗室預先確定的工作負荷來設定的，目的是在工作負荷較低的日子進行手術，避免周末手術，并適應醫師的需要。因此，基于這種隨機分配，形成了2組。根據取精時間與授精時間差分成取精當日ICSI組與取精次日ICSI組。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 精液檢查：所有患者禁欲2～8d，手淫方法取精。記錄禁欲時間，按照WHO精液分析手冊行精液常規檢查。無精子癥患者需反復3次以上檢查。無精液癥患者行高潮后尿液離心鏡檢，以鑒別逆行射精。

1.2.2 手術取精：患者取仰臥位，常規消毒、鋪巾，0.5%利多卡因行精索阻滯和陰囊皮膚局部浸潤麻醉，固定一側附睪（或睪丸），采用8號針經皮穿刺附睪（或睪丸），由助手用10mL注射器維持負壓8～10mL，直至吸取附睪液（或睪丸組織條）。

1.2.3 手術取精后精液處理：將附睪液鏡下直接觀察，密度梯度離心法制備精子；將睪丸組織放入3mLHTF-HEPES培養液中，將其在培養皿底部的井字劃痕上來回搓動，磨碎曲細精管，鏡下觀察可見精子，組織懸液離心10min后棄上清液，加入0.2mLHTF-HEPES，獲得的睪丸組織懸液作10μL長滴。

1.2.4 ICSI授精：卵子經過透明質酸酶（美國Sigma公司）剝除顆粒細胞后，轉移培養液滴中行ICSI。受精后16～18h，胚胎轉移至培養液中培養，顯微鏡下觀察受精情況，見到雙原核和雙極體為正常受精。

1.2.5 胚胎質量評估：2 組患者所獲得的成熟卵母細胞行ICSI操作，成功受精后體外培養至第3天（D3），結合本中心臨床操作實際經驗，對胚胎進行評分，選擇優質胚胎進行移植。優質胚胎的標準[8]為：正常受精發育而來的胚胎，卵裂球數目7～9個，碎片≤15%，卵裂球無明顯大小差異，定義為I級胚胎；可移植胚胎的標準為：卵母細胞正常受精后第3天形成細胞數量≥4個且級別在II級以上的胚胎。其余胚胎繼續培養至囊胚期，行冷凍保存。

1.2.6 胚胎移植和妊娠檢查：選擇評分最高的2～3枚胚胎進行移植，剩余胚胎進行囊胚培養，以移植后4周陰道B超下出現孕囊和胎心為臨床妊娠[9]。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件對數據進行處理。計量資料采用表示，2組比較采用t檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基礎情況 共839例外科手術取精。依據臨床診療指南[10-11]進行患者分類，其中梗阻性無精子癥689例（占82.1%），非梗阻性無精子癥55例（占6.6%），勃起功能障礙33例（占3.9%），不射精33例（占3.9%），逆行射精9例（占1.1%），重度少精子癥13例（占1.5%），重度弱精子癥7例（占0.8%）。

2.2 2組一般情況比較 共839新鮮周期ICSI，取精當日ICSI組396例（附睪289例，睪丸107例），取精次日ICSI組443例（附睪307例，睪丸136例）?；颊吣挲g為27～39歲，不育年限（4.0±3.0）年，當日ICSI組與次日ICSI組比較，2 組的不育年限、女性年齡、獲卵數、女性BMI、移植胚胎數差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。胚胎體外培養和臨床結果顯示2組的受精率、成熟率、卵裂率、D3優質胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產率差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 2種取精方式臨床結局 2種取精方式（附睪、睪丸取精）當日ICSI與次日ICSI受精率、成熟率、卵裂率、D3優質胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產率差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3-4。

表1 外科取精當日ICSI組和次日ICSI組患者的生理特征

表2 外科取精當日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發育和臨床結果（%）

表3 附睪取精當日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發育和臨床結果（%）

表4 睪丸取精當日ICSI組和次日ICSI組胚胎體外發育和臨床結果（%）

3 討論

輔助生殖中外科取精ICSI治療，通常取精安排在取卵當天進行，取精手術可以安全地推進到女方取卵手術前一天[12]。采用這種做法可能會給夫妻雙方和醫療團隊帶來一些實際的好處，其中包括：①實驗室工作人員有足夠的時間仔細搜尋精子[13]；②更好地規劃實驗室和手術室的活動；③在壓力較小的條件下，夫婦有更多時間考慮使用供精的可能性，同時男性患者在配偶取卵日無需再次手術，可參與配偶取卵后護理。因此提前一天外科手術取精是臨床上可行的一種治療手段，對ICSI治療有益。

有研究表明，精子體外培養可促進細胞分化及提高精子活動力，因而建議手術取精可以在取卵前一天進行[7]。但也有研究證實精子在體外環境培養時間延長，細胞代謝產生的活性氧可能影響細胞膜流動性和DNA穩定性，精子DNA碎片會增加[14]，進而影響胚胎的發育潛能，從而降低臨床妊娠率和增加流產率[1，15]。本研究結果表明，在培養基中過夜培養對精子活力沒有不利影響。胚胎移植后，在數量和質量上比較，新鮮精子和過夜培養精子的植入率和臨床妊娠率分別為34.4%和35.4%，這與KARACAN等[16]的研究類似。使用新獲得的精子與延長培養的精子相比，臨床妊娠率在附睪取精組相同，睪丸取精組有5%的差異，提示睪丸精子提前一天獲取可能獲得較好的臨床結果，這可能跟體外培養后睪丸精子活力增強有關[17]，但睪丸組織體外培養的最佳物理和化學方法尚未確定，同時這種差異沒有達到統計學意義，這可能與樣本量有關。

非梗阻性無精子癥患者睪丸存在生精障礙或阻滯，對生精阻滯的精子，延遲體外培養時間，精子成熟度可能趨于好轉。ESTEVES等[18]能尋見精子并行ICSI的非梗阻性無精子癥精子只能在睪丸極少局灶部位被找到，因此尋找精子的難度明顯增加。一旦尋見精子并實現活產，胎齡、出生體質量、圍產期死亡率和畸形率似乎不受睪丸生精功能障礙的影響[18]，但對外科取精ICSI的子代安全性還有待更多的人群分析持續監測。顯微外科取精可增加精子獲取率[19-20]，對未獲得精子的非梗阻性無精子癥，以供精治療，非梗阻性無精子癥精子獲取率不在本研究范圍。非梗性無精子癥外科可獲得精子的臨床治療結局52.7%（29/55），而梗阻性無精子癥組臨床妊娠率56.0%（386/689），兩者差異無統計學意義，本研究結果提示睪丸生精功能障礙并未對ICSI治療結局有不利影響，但仍需更大樣本量證實。

GRECO等[21]研究發現同一患者精液精子中的DNA損傷較睪丸精子明顯增加，并認為精子DNA損傷主要由于睪丸后的氧化應激，因此推薦在臨床中應優先選擇睪丸精子行ICSI受精。另一種觀點認為，大多數精子只有到達附睪遠端后，在附睪及輸精管分泌的特定物質的作用下才得以成熟并獲得受精的能力[22]，因此推薦在臨床中應優先選擇附睪精子行ICSI受精。對外科取精精子行相關檢查分析，將更有利于了解外科不同部位獲取的精子質量，從而進一步探討外科取精部位對輔助生殖技術的影響。遺憾的是，我們之前并未對睪丸、附睪精子行精子DNA碎片分析，有待后續進一步研究。但不管是附睪精子還是睪丸精子，當日授精與次日授精在受精率、成熟率、卵裂率、D3優質胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產率差異均無統計學意義，外科取精時間并不影響輔助生殖臨床結果。

綜上所述，無論是采用附睪精子還是睪丸精子，提前一天手術取精并未對ICSI結局有顯著影響。但由于本研究樣本量小，局限于胚胎早期發育和臨床妊娠方面，缺少附睪和睪丸精子DNA碎片分析結果，仍需進一步研究證實。