金絲桃素介導的光動力學療法對K562細胞活性與自噬的影響

王德選，王萬鐵，鄭綠珍，陳偉偉，楊青，莊捷秋，許益笑，

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院小兒腎內科，浙江溫州325027；2.溫州醫科大學基礎醫學院病理生理教研室，浙江溫州325035）

我國白血病年發病率為3～4/10萬，且呈逐年增加趨勢[1]。目前白血病治療方式主要有化療、藥物靶向治療、骨髓和干細胞移植等，取得了一定的治愈和緩解效果，但存在不同程度的化療藥物耐藥及不良反應、移植配型困難、費用高昂等缺點。因此，在原有治療基礎上，探索一些安全有效的輔助治療方法顯得極為重要。

金絲桃素（hypericin）是植物貫葉連翹提取物的主要活性成分之一，臨床上已作為抗病毒、抗抑郁藥物應用多年，具有很高的藥物安全性[2-3]。另外金絲桃素作為一種天然光敏劑，還具有低光照下毒性低和光依賴性抗腫瘤活性強的雙重特點，可對較多實體腫瘤實施光動力學治療作用[4]。金絲桃素容易被白細胞等有核血液細胞攝取，但封閉血管系統中流動的各種血細胞都無法直接照射，也限制了金絲桃素介導的光動力學療法（hypericinmediated photodynamic therapy，Hyp-PDT）在血液系統疾病的應用。本課題組研制了倒置可調功率光動力學照射平臺，通過體外循環實施Hyp-PDT（另文發表）并研究其相關機制。本研究主要探索Hyp-PDT對體外培養的K562細胞株的殺傷作用及對自噬通路的影響，希望為Hyp-PDT引入外周血白血病的治療提供理論驗證，改善白血病患者的健康。

1 材料和方法

1.1 材料 K562 細胞株購自上海生科院細胞資源中心；高純度金絲桃素購自美國Sigma公司。CCK-8分析試劑盒購于日本Dojindo Laboratories；Beclin-1、LC3 及Akt兔多克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司；二抗為美國Jackson ImmunoResearch公司產品；培養基RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 細胞培養 含10%胎牛血清的1640培養液中添加100μg/mL鏈霉素和lOOU/mL青霉素，培養箱條件為5%CO2，37℃。根據實驗設計，在超凈臺暗環境下進行細胞分組，細胞密度調整為約5×105個/mL。

1.3 光動力學干預及CCK-8 法測定細胞活性 將K562細胞懸液分為3組接種于96孔板：金絲桃素組培養液中含0.4μg/mL金絲桃素及DMSO助溶劑；正常細胞組培養液中添加等體積0.9%氯化鈉溶液；DMSO組培養液中含有等體積DMSO。每孔含培養液100μL。避光孵育4h，用0.3mW/cm2的光強度（預實驗獲得的最佳光照強度）對樣品照射4min。

10μLCCK-8溶液分別于光照前、光照后5min、4h、8h和16h不同時間點加入每孔培養液中（每個時間點5孔）。每個96孔板空白對照孔均加入等量CCK-8溶液、藥物以及不含細胞的細胞培養液。繼續避光孵育1h后測定每孔的吸光度值（OD值），酶標儀測定波長為450nm。

細胞活力=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100%。A（加藥）：每孔含細胞、金絲桃素培養液的OD值。A（空白）：每孔含金絲桃素培養液而無細胞的OD值。A（0加藥）：每孔含細胞及培養液，但無金絲桃素的OD值。

1.4 光動力學干預前后K562細胞形態及自噬體數量變化 在6cm培養皿中加入濃度為0.4μg/mL的金絲桃素培養液及K562細胞懸液，避光孵育4h，以主波為595nm波長的LED燈照射4min，細胞位置光強度為0.3mW/cm2。顯微鏡下觀察照射前、照射后8h、照射后16h細胞形態學變化。另設未加金絲桃素的細胞作為對照（DMSO組）。

細胞分組及干預同上，在照射前、照射后8h收集細胞懸液，經1200r/min離心10min，棄上清液，細胞團與2.5%戊二醛液充分混勻固定，經過漂洗、塊染、梯度脫水、包埋等常規步驟，制成厚度約80nm的切片，枸櫞酸鉛-30%醋酸鈾雙染色，透射電鏡（JEM-l00CXII）下觀察自噬體數量。

1.5 Western blot測定Hyp-PDT對K562細胞自噬相關蛋白的影響 細胞分組及干預同1.4。于光照前即刻，光照后4、8、16h離心收集細胞懸液，細胞裂解（RIPA液）后低溫下15000r/min離心15min，取上清液待用。各組蛋白濃度配平后將樣品與預熱的6×Loading充分混勻，100℃水浴5min。每孔添加40μg蛋白樣品后進行10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，濃縮膠電壓70mV，分離膠電壓120mV。冰浴下恒流轉膜（300mA）90min，依次一抗孵育4℃過夜（稀釋濃度均為1:1000）、二抗室溫孵育2h（稀釋濃度1:12000），ECL顯色。使用Bio-Rad顯像儀收集圖像，并用附帶軟件對目的條帶進行量化分析。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS22.0進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hyp-PDT對K562細胞活性的影響 0.3mW/cm2光照強度下4min后，CCK-8法檢測結果顯示，正常細胞組、DMSO組光照前后細胞活性無明顯變化，且2組間在同時間點細胞活性差異無統計學意義（均P＞0.05），提示光照對K562細胞活性無明顯影響。金絲桃素組光照后細胞活性隨時間延長逐漸降低，與光照前比較，差異均有統計學意義（P ＜0.01），且與正常細胞組、DMSO組比，所有時間點的細胞活性均顯著降低（均P＜0.01），見表1。

表1 0.3mW/cm2光照強度下各組K562細胞活性比較（每組n=5，%）

2.2 Hyp-PDT對K562細胞形態的影響 DMSO組和金絲桃素組光照前細胞在相差顯微鏡下呈現為孤立性或者集落性分布的半透明球狀細胞，邊界清晰，折光性強（見圖1A和1D）。Hyp-PDT干預后，細胞生長變慢，部分細胞不能貼壁生長，細胞的集落生長規律被破壞，可觀察到大量細胞邊界模糊，胞質空泡化，折光性顯著下降，亦有部分細胞出現腫脹變性甚至溶解破裂（見圖1B和1C）。

圖1 相差顯微鏡觀察Hyp-PDT對K562細胞形態學的影響（×400，箭頭所示為空泡化及嚴重變形的K562細胞）

2.3 Hyp-PDT對K562細胞自噬小體的影響 電鏡顯示：在DMSO組及金絲桃素組照射前收集的K562細胞中可觀察到具有典型的雙層或多層膜結構，膜內包含細胞器或者胞漿成分的自噬體（見圖2A和2C），DMSO組光照后8h胞漿內自噬體數量較前增多（見圖2B），但金絲桃素組光照后8h自噬體幾不可見（見圖2D）。

2.4 Hyp-PDT對K562細胞自噬相關蛋白的影響 免疫印跡結果顯示：與照射前比較，金絲桃素組照射后8h和16h的LC3蛋白表達量明顯下降，DMSO組LC3蛋白含量則略有升高（P＜0.05）；金絲桃素組的Beclin-1蛋白在光照后16h時與DMSO組比較出現表達下調（P＜0.01），同期p-Akt蛋白表達量也明顯減少（P＜0.05），但總Akt表達量在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3-4。

3 討論

國內外近年來的研究表明Hyp-PDT對較多腫瘤細胞具有強大的殺傷作用，例如可誘導約94%的皮膚T細胞惡性淋巴瘤細胞進入凋亡狀態[5]。本研究結果表明，在光強度為0.3mW/cm2條件下，Hyp-PDT可顯著降低K562細胞的活性，且隨培養時間的延長，部分細胞出現腫脹變性甚至溶解破裂，表明Hyp-PDT對白血病細胞也有強大的細胞毒性作用。

圖2 電鏡下K562細胞的自噬改變（箭頭所示為自噬體）

適度的自噬有助于腫瘤細胞生存，減少發生凋亡的可能[6]。腫瘤細胞面臨缺氧、藥物作用等不利因素時，細胞質成分進入自噬途徑降解為細胞可以重新利用的氨基酸等原料，有助于細胞存活；同時細胞內老化及受損的細胞器和無功能蛋白質可通過自噬途徑清除，維持細胞DNA穩定性，避免發生凋亡，這是臨床上抗癌治療出現耐藥性的原因之一[7]。但自噬過強會引起胞漿成分被大量降解，同時自噬溶酶體酶可剪切激活某些促凋亡因子，誘導細胞進入凋亡程序；而自噬受到過度抑制也會導致胞漿內容物清除障礙，引起腫瘤細胞死亡[7]。

急性白血病的相關研究表明，細胞內自噬可促進白血病細胞存活與增殖[8]，由于包括白血病在內的腫瘤細胞常常存在自身凋亡機制失效，故腫瘤細胞較正常細胞更加依賴自噬的調節作用[9]，提示抑制自噬可能有助于急性白血病的治療。本研究觀察到，K562細胞在培養過程中出現典型的自噬體，且在光照后增多，Westernblot結果顯示，自噬相關LC3蛋白的表達量在光照后8h和16h也有所增加，證明白血病K562細胞中存在自噬現象，而增多的自噬體可能是白血病細胞應對營養供應減少、細胞器受損等情況出現的自身保護現象。

LC3 蛋白多表達在自噬體及與前自噬體膜上，為常見自噬體標志物，觀察LC3蛋白表達水平變化可以間接確認自噬程度的情況[10]。另外自噬前體結構的重要自噬蛋白Beclin-1可介導自噬小泡的成熟，調節自噬活性，與腫瘤的發生和發展有關。文獻報道Beclin-1 基因敲除后的小鼠細胞自噬減少，其肝癌、肺癌的發病率顯著提升[11]。有報道提出光動力治療產生的活性氧可以誘導自噬[9]。本研究發現，金絲桃素組在0.3mW/cm2光照射后8h和16h時的LC3蛋白表達顯著減少，光照后16hBeclin-1表達量也出現下調。電鏡下亦觀察到光照后金絲桃素組的自噬體顯著減少，自噬蛋白水平的變化與自噬體數量的變化相一致。以上結果提示實施Hyp-PDT可抑制白血病K562細胞的自噬。實驗中檢測到p-Akt蛋白表達的同步下降，則提示Hyp-PDT誘導的自噬改變可能與PI3K-Akt通路有關[12]。

綜上所述，Hyp-PDT可能通過抑制Akt磷酸化，減少K562自噬，促進細胞死亡，起到殺傷白血病腫瘤細胞的作用。