植物鋅指蛋白轉錄因子家族研究進展①

李 琳 丁 峰 潘介春 張樹偉 黃 幸 王金英 王 穎李浩然 徐炯志 彭宏祥 何新華(1 廣西大學農學院 廣西南寧530004;

2 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室 廣西南寧530007;

3 廣西壯族自治區農業科學院園藝研究所 廣西南寧530007;4 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室 廣西南寧530004)

鋅指蛋白存在于真核生物中，是最重要的轉 錄因子之一。轉錄因子可直接結合或間接作用于基因啟動子，進而形成具有RNA聚合酶活性的動態轉錄復合體的蛋白質因子，通過激活或抑制基因的轉錄，起到調控基因表達和生物體功能等作用，完成生物在轉錄水平上的調控［1］。根據其功能方面的差異，轉錄因子可分為通用轉錄因子、序列特異性轉錄因子和輔助轉錄因子等。與RNA聚合酶I、II 和III 相對應的轉錄因子有3 類，分別是TFI、TFII 和TFIII，鋅指蛋白為TFIII 型轉錄因子［2］，它是目前發現的種類最廣泛，在真核生物的生長發育以及抗逆過程中具有重要調控作用的一類核酸結合蛋白。

鋅在植物生長過程中發揮著不可或缺的作用，對于鋅指蛋白，鋅的存在也極其重要，不僅是鋅指蛋白發揮作用的關鍵，鋅指功能的有效性也依賴于穩定的鋅指結構。如果使用鋅離子螯合劑脫鋅或用Fe、Al、Cu、Ag、Mn 等其它金屬離子代替鋅離子后，鋅指蛋白與DNA 或RNA 等結合特異性就會被明顯抑制，不能形成折疊結構的同時，穩定的蛋白也會失去支撐力，影響基因表達及脅迫響應，使其喪失大部分功能。鋅指序列主要存在于轉錄因子中，并在轉錄水平上響應及參與真核生物生長發育，并對生物及非生物脅迫做出反應［2］。

1 鋅指蛋白轉錄因子概述

Bogenhagen等［3］于1982年發現TFIIIA參與非洲爪蟾卵母細胞5SRNA基因的調控，現已在各種植物、動物及酵母中均發現了參與基因調控的鋅指蛋白［4-5］，該蛋白質由一致序列的九次不完全重復組 成：（Tyr，Phe） -X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe -X5-Leu-X2-His-X3-4-His-X2-6（其中X 是任何氨基酸），這些陣列結合5S RNA 基因中的43 bp 序列［6］，顯著特征是具有“手指狀”結構域且能與Zn2+結合。SPl屬于典型的TFIIIA類型的鋅指蛋白，其中兩個Cys 和兩個His 與鋅離子形成配位鍵，從而形成一個包含β發夾和α螺旋的緊密指狀結構。植物鋅指蛋白中一般包含有1 到4 個數目不等的鋅指結構（圖1）［4］。

研究發現，擬南芥中包含176個鋅指蛋白，構成了該植物中最豐富的轉錄因子家族，其中有33個為在其它真核生物中保守的擬南芥鋅指蛋白，剩下大多數（約81%）為植物特異性鋅指蛋白［2］。目前研究較為廣泛的一類為真核生物基因組中含量最多的C2H2型鋅指蛋白，除含有DNA 結合區DBD（DNA-binding domain）外，通常還具有參與亞細胞定位的核定位信號區NLS （nuclear localiza‐tion signal，也稱B-box）［7］，該蛋白與DNA 接觸面有一段高度保守的氨基酸序列QALGGH，為植物鋅指蛋白所特有，其中Q 若突變則會極大降低蛋白結合DNA 的能力，除Q 外其他任何一個氨基酸的突變都會導致該蛋白完全喪失結合DNA 的功能［8］。C2H2型鋅指蛋白常見于植物中，不僅是染色質結構的重要組成部分，在轉錄調控中也發揮重要作用。

2 鋅指蛋白轉錄因子的分類

根據鋅指蛋白在指狀二級結構中與鋅離子結合的半胱氨酸和組氨酸殘基的數量和順序的不同，Berg 和Shi 將鋅指蛋白分為9 大類：C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH（C 和H 分別代表半胱氨酸和組氨酸）（表1）［9］；根據鋅指Cys和His 殘基所構成的空間結構不同，Krishna 等［10］把鋅指蛋白分成8個不同的折疊群：類C2H2型鋅指、高音譜號鋅指、帶狀鋅指、塞結狀鋅指、Zn2/Cys6 型鋅指、類TAZ2 型鋅指、鋅離子結合短環鋅指、金屬硫蛋白鋅指，其中前3類組成了大部分的鋅指［10］；根據鋅指蛋白的功能差異，可分為TFIII蛋白、WRKY 蛋 白、RING 蛋白、GATA 蛋白、PHD 蛋白、DOF蛋白等亞家族。

表1 9類鋅指蛋白的序列及其代表蛋白質

3 鋅指蛋白轉錄因子家族的生物學功能

在植物生長過程中，各種不同的脅迫因素嚴重影響植物的生長發育及作物產量。植物在漫長的進化過程中，通過調節細胞內基因表達的模式形成了一系列的脅迫響應保護機制，越來越多的基因和蛋白在應答脅迫中發揮重要作用。其中鋅指蛋白已被證實與生物體內的各種RNA 代謝有關［11］，廣泛參與基因的轉錄、翻譯、mRNA 的運輸、細胞支撐、蛋白折疊和染色質修飾等過程，對植物基因表達及調控起著重要作用［12］。

3.1 對植物的生長發育調控

鋅指蛋白廣泛參與植物的生長發育過程，例如種子萌發及成熟、根系發育、花器官及配子發育、激素反應、葉片衰老和細胞凋亡等［6］。

3.1.1 參與植物種子萌發及成熟

種子發芽受外界環境條件和內源激素的控制，ZFP3是C2H2型鋅指蛋白家族的一員，在擬南芥中充當ABA，作為抑制種子發芽的負調節劑。研究表明過表達ZFP3 和與之密切相關的ZFP1、ZFP4、ZFP6及ZFP7 鋅指蛋白因子使ABA 對種子發芽不敏感，而ZFP3、ZFP4 雙突變體則顯示出更高的ABA 敏感性。通過觀察ZFP3 過表達植物的生長狀況，顯示了多種表型改變，例如半矮生生長習性、繁殖力缺陷以及下胚軸伸長對紅光或藍色光的敏感性增強。用光敏色素和遺傳相互作用分析ABI 突變體，表現出ZFP3 通過除光敏色素A 之外的感光增強，這些數據基本可以得出：ZFP3 和鋅指因子相關的ZFP 亞家族在植物發芽和幼苗早期發育期間調節光和ABA響應，影響植物的生長發育和繁殖能力，并調節幼苗光形態發生過程中的紅光信號，此外ABA還控制植物對干旱和鹽脅迫的響應，包括氣孔關閉、與滲透調節有關的基因激活［13］。擬南芥中ARS1 編碼具有一個鋅指結構域、一個核輸出信號（NES）域和兩個核定位信號（NLS）域的核蛋白，ARS1 突變體表現出降低超氧化物歧化酶基因的表達，并在ABA處理后提高了活性氧（ROS）的積累。ARS1在擬南芥原生質體中的瞬時表達強烈抑制ABA介導的ROS產生，說明ARS1能夠響應ABA和氧化脅迫，進而調節種子的萌發［13］。OsZF77基因是屬于CCCH型鋅指類的一個核酸結合蛋白，編碼280個氨基酸，通過將OsZF77啟動子區和GUS 融合基因導入水稻中觀察發現：在胚乳尤其是靠近種皮外圍的胚乳中GUS 基因活力較強，胚中未檢測到GUS 活性。通過對OsZF77進行“RT-PCR”分析、生物信息學分析和GUS的融合表達分析表明，該基因是一個胚乳優勢表達基因，結合該基因在種子中的表達模式，進一步驗證了OsZF77基因的啟動子在種子胚乳中的優勢表達活性，也表明了該基因可能在種子胚乳發育過程中起著重要的調節作用［14］。夏苗［15］通過酵母激活實驗分析證明了ZmZFP1（Zea maysL.ZFP1）具有轉錄激活活性，ZmZFP1轉錄因子具有典型的鋅指蛋白二級結構、三級結構，與其親緣關系較近的基因都含有保守結構域，通過Plant-CARE 程序預測ZmZFP1的啟動子元件，發現啟動子中含有ABA誘導的順式作用元件，實時定量PCR分析得到該轉錄因子在胚乳中的表達結果與測序分析的表達結果一致，ZmZFP1基因上調表達可被ABA 誘導。通過檢測GUS 和LUC 酶的活性也驗證了ZmZFP1能提高啟動子Sh2、Bt1、Wx 活性，從而使ZmZFP1能參與以及促進淀粉合成酶相關基因的表達。

3.1.2 參與植物花器官及配子發育

授粉是植物花粉和柱頭、花柱傳遞組織之間的一系列復雜的細胞識別和信號傳導過程［16］。HUA1 屬于CCCH 型鋅指蛋白，在擬南芥花發育過程中，HUA1 參與了RNA 結合蛋白AGAMOUS 前mRNA 的加工［17］。在矮牽牛中，PetSPL3可通過控制特定細胞類型的細胞分裂和/或擴增，參與各種營養器官和生殖器官的發育調控，推測矮牽牛中的幾種花藥特異性鋅指蛋白均參與花藥生殖組織和非生殖組織中配子的調控［17］。

3.1.3 鋅指蛋白參與植物葉片衰老

植株葉片衰老是由其生長發育環境和和體內調控網絡主導的。孔照勝［16］研究發現一個新的CCCH 型蛋白OsDOS，該蛋白有2 個CCCH 鋅指結構域［14］，OsDOS-GFP 融合蛋白定位于細胞核，RNAi（RNA interfere）抑制OsDOS 在葉片自然衰老、果實發育過程中的表達，加速葉片衰老進程。OsDOS過表達植株表現嚴重的發育遲滯和明顯的葉片衰老延緩，以此推測OsDOS作為植物葉片衰老過程的負調控因子。在OsDOSRNAi株系中茉莉酸信號通路的基因表達顯著上調，而在OsDOS過表達株系中這些基因表達抑制或變化不明顯，表明茉莉酸信號通路可能參與了OsDOS 介導的對葉片衰老的調控。此外，OsDOSRNAi 過表達株系的種子和離體葉片對茉莉酸甲酯的處理分別表現出過度敏感和低敏感反應，進一步表明該蛋白很可能通過調控發育信號和茉莉酸信號通路的整合來延緩水稻葉片衰老。通過對棉花細胞壁再生SSH 庫中分離出來的CCCH型串聯鋅指基因GhTZF1 進行鑒定，該基因主要在早期細胞壁再生過程中表達，在各種營養和生殖組織中也有表達。在干旱脅迫條件下，轉基因植物中的超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性明顯高于野生型植物，在干旱和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下，轉基因植物中H2O2的量減少，實時定量PCR分析結果表明，GhTZF1的過表達降低了氧化相關衰老基因的表達。通過在H2O2處理期間轉基因植物中改變的一組抗氧化劑基因表明，GhTZF1的過表達也增強了氧化應激耐受性，因此，GhTZF1可以通過調節活性氧的穩態來介導植株干旱脅迫耐受性和葉片衰老［18］。

3.1.4 鋅指蛋白參與植物細胞凋亡

植物細胞程序化死亡（PCD）是由復雜的信號轉導網絡控制的，轉錄因子在調節植物防御基因表達和抗性反應上發揮著關鍵作用。C2C2型鋅指蛋白在擬南芥中占轉錄因子總數的6.78%，在水稻中占4.67%，由GATA、CO-like、Dof、YABBY 和 類LSD1 （lesions stimulating disease resistance 1）共5 個基因家族組成，除GATA 外其他都是植物所特有的基因家族［19］，其中類LSD1 基因家族編碼一類特殊的C2C2型鋅指蛋白，結構域一般由25個保守的氨基酸殘基組成。研究發現擬南芥LSD1 和LOL1（LSD-One-Like 1）均參與植物PCD 的調控，對從擬南芥類LSD1 中克隆出的AtLSD1和AtLOL1進行功能驗證發現：AtLSD1基因是作為植物PCD的負調節因子，限制植物對外界刺激的反應以及后期細胞死亡的擴展，而AtLOL1是植物PCD 的正調節因子，在擬南芥中過量表達可降低植株對毒性病菌的敏感性。對從水稻類LSDI 中克隆出的OsLSDI進行初步探究發現：該基因可作為植物愈傷組織分化的正調節因子和植物PCD的負調節因子。目前發現半胱天冬蛋白酶（caspase）在動物PCD 過程中起主導作用，在植物中還未發現其直系同源蛋白，但發現一類metacaspase 蛋白酶，與其結構高度相似，對metacaspase 基因的結構和主要功能進行初步探究，發現29個植物物種均含有metacas‐pase 基因［20］。根據差異表達分析結果推測擬南芥中9 個metacaspase 基因不同程度地參與了細胞對外界刺激反應的過程，且存在于不同的功能模塊內，在生物學功能上也存在一定差異。在擬南芥和水稻中均有2 個含有metacaspase p20 亞基的蛋白質，p20 亞基能夠獨立引起細胞凋亡［21-22］，可基本判定這4 個蛋白質都參與了植物PCD 的調節。通過進一步的研究，發現此類相關基因不僅在植物PCD 中發揮作用，同時也參與細胞物理、化學、生物因子等對外刺激的反應過程［23］。此外桿狀病毒凋亡重復序列（BIR）包含CCHC配位基序，保守結構域核心由中央三鏈β片段和4 個短α螺旋組成，許多BIR結構域蛋白都可通過抑制胱天蛋白酶而參與程序性細胞死亡的調控［23］。

3.2 鋅指蛋白參與植物脅迫調控

由于外界自然環境條件復雜多變，植物在其生長發育過程中經常遭受非生物因素和生物因素等逆境脅迫，導致植株生長受到抑制、損害、作物產量下降甚至死亡，影響農業生產和生態環境。目前關于鋅指蛋白的研究為其參與植物脅迫耐受性機理提供了依據，并為改善植物的脅迫耐受性提供了重要的方法。

3.2.1 參與植物的非生物脅迫調控

通過PCR輔助方法從擬南芥中克隆了鋅指蛋白基因家族的4個不同成員，一個與已經報道的基因STZ/ZAT10相同，其余3 個為尚未鑒定的基因，將其命名AZF1（擬南芥鋅指蛋白1）、AZF2和AZF3。AZF 和STZ 編碼的蛋白質與兩個手指的半胱氨酸的其他成員一樣，都包含兩個典型的半胱氨酸鋅指圖案，由長的墊片隔開，在鋅指基序之外還識別出3 個保守區域，分別稱為B-box，L-box 和DNLbox，這4 個基因位于鋅指基序序列構建的系統樹的同一分支上，進一步表明了它們的結構和功能關系。通過RNA 印跡分析表明：4 個基因主要在根中表達，并在其他器官中也有不同水平表達；4 個基因的表達均對水分脅迫有反應，高鹽處理會導致這些基因的表達水平升高，低溫處理增加了AZF1、AZF3和STZ表達的水平， ABA 處理可誘導AZF2表達，其中誘導的時間及過程與高鹽誘導的時間過程相似（ABA 可控制植物對干旱和鹽脅迫的響應，包括氣孔關閉、與滲透調節有關的基因激活［13］）。原位定位表明AZF2在鹽脅迫條件下，mRNA 積累在根的伸長區中。這些結果表明AZF1、AZF2、AZF3和STZ它們都以ABA 依賴性或非依賴性途徑參與調控水分脅迫的下游基因（表2）［24］。

OsTZF1是水稻CCCH型鋅指家族的一員，干旱、高鹽脅迫以及過氧化氫誘導了OsTZF1基因的表達，OsTZF1基因的表達也可被脫落酸、茉莉酸甲酯和水楊酸誘導。在水稻胚芽鞘、幼葉、愈傷組織和穗組織中均觀察到含有OsTZF1啟動子與β-葡萄糖醛酸酶融合組織的化學活性。有壓力存在時細胞質中可觀察到OsTZF1綠色熒光蛋白定位。結合RNA測定表明OsTZF1可能與應激反應基因的RNA 代謝有關。OsTZF1的轉基因水稻植株表現種子萌發延遲、苗期生長緩慢和葉片衰老延遲癥狀，與對照相比，RNAi 的植株表現為種子萌發早、幼苗生長快、葉片衰老早。OsTZF1在植物中過度表達（OsTZF1-OX）時，植物對干旱和高鹽脅迫有很好的耐受性，反之亦然，OsTZF1可以作為一種生物技術工具，通過控制脅迫響應基因的RNA代謝來改善各種植物的脅迫耐受性［25］。

從水稻中分離克隆得到OsCOIN轉錄因子，觀察發現OsCOIN在轉基因水稻品系中的過表達顯著增強了植株對寒冷、鹽和干旱脅迫的耐受性，細胞脯氨酸水平隨著OsP5CS表達的上調而增加［26］。氣孔控制CO2的吸收并優化水分利用效率，H2O2是誘導氣孔關閉的重要信號分子，通過克隆并鑒定DST（抗干旱和耐鹽性）鋅指轉錄因子，發現它通過直接調節H2O2相關基因的表達進而負調控氣孔關閉。DST 功能喪失會促使氣孔關閉，降低氣孔密度，從而提高水稻的抗旱性和耐鹽性。

3.2.2 參與植物的生物脅迫調控

由水稻黃單胞菌（Xoo）引起的細菌性枯萎病是全世界范圍內最嚴重的水稻病害之一，先前的研究表明［27］，鋅指蛋白家族成員水稻cDNA EI38D7（GenBank 登錄號BF108310）是防御反應基因，它的表達在水稻對Xoo的抗性中被誘導（表3）。

從接種無毒黃單胞菌辣椒葉中分離出編碼C2H2型鋅指轉錄因子的辣椒鋅指蛋白基因CaZFP1，該CaZFP1蛋白是核靶向蛋白質，全長沒有轉錄激活活性，其功能是作為轉錄調節，而CaZFP1的C 端區域具有反激活活性。該CaZFP1轉錄因子在胡椒莖、根、花和紅色果實中均表達，但在葉和綠色果實中未能檢測到。CaZFP1響應于炭疽菌，Ca‐ZFP1轉錄基本定位于辣椒葉中脈中維管束的韌皮部細胞，非生物激發子和環境脅迫可以更早地誘導CaZFP1基因。在轉基因擬南芥植物中過表達CaZFP1基因不僅增強了對丁香假單胞菌PV 感染的抵抗力還增強了番茄的耐旱能力［59］。

表2 鋅指蛋白轉錄因子在非生物脅迫中的調控作用

表3 鋅指蛋白轉錄因子在生物脅迫中的調控作用

4 鋅指蛋白的轉錄調控機制

非洲爪蟾的5S 基因特異性轉錄因子TFIIIA 中的九個串聯鋅指重復序列與5S DNA和5S核糖體RNA特異性結合，進一步說明了鋅指蛋白可與DNA 或RNA 進行特異結合。TFIIIA 與DNA 結合的機制較為復雜，氨基末端的3 個鋅指識別一個13 bp 的序列并結合在主溝中，這些指狀結構主要在DNA的一條鏈上和鳥嘌呤進行接觸。α螺旋表面上的特定組氨酸（非鋅配位其殘基）和精氨酸殘基參與了DNA識別，緊接在α螺旋之前和在螺旋位置2、3 和6 處（在保守的組氨酸之前）的帶電荷氨基酸參與DNA鳥嘌呤的氫鍵結合。TFIIIA 的第2 指在這些DNA 接觸位置上含有組氨酸和精氨酸殘基，并發現TFIIIA 的第4 指至第7 指貢獻了TFIIIA 結合5S rRNA 的95%的自由能，而第1～3 指在結合啟動子方面做出了類似的貢獻。此外，這些鋅指中的每一個都最低限度地識別序列GGG，誘變實驗還顯示了這些氨基酸在指定DNA識別中的重要性［6］。

鋅指蛋白不僅可以識別DNA 和RNA，還能與DNA-RNA 雜交雙鏈分子及其他鋅指蛋白或自身結合，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達。DNA 結合鋅指蛋白的3 個不同基序為：鋅指（i）、鋅簇（ii） 和鋅扭曲（iii）［61］。酵母轉錄激活因子（GAL4）和DNA 結合結構域是第1 個被確定的，該蛋白內包含兩個鋅結合位點，并且在蛋白質中半胱氨酸殘基是唯一的鋅配體。在GAL4 中，兩個鋅原子結合6個半胱氨酸殘基，形成與金屬硫蛋白類似的“鋅簇”，GAL4 的兩個鋅原子之間的距離約為3.5 A，在糖皮質激素受體中，每個鋅原子與4 個半胱氨酸殘基結合，“鋅扭曲”由位于兩個鋅原子之間的螺旋DNA識別位點表示。在包含多個鋅原子的DNA結合蛋白中，鋅簇和鋅扭曲參與調節基礎代謝、次生代謝、減數分裂等過程。

5 展望

鋅指在結構上是多樣化的，它存在于蛋白質一級結構中，在細胞增殖和代謝、轉錄和翻譯、信號轉導和凋亡等過程中發揮廣泛的功能。鋅指在與多種化合物，如核酸、蛋白質和小分子等結合過程中起著交互模塊的作用，其結構研究為其功能的多樣性和特異性提供了新的依據。目前已經確定的大量推定的鋅指圖案中，只有少數在結構上得到了表征，要闡明鋅指蛋白的結構、功能和作用機理還需要繼續研究。目前已經明確的是，這些小的、獨立折疊的蛋白質結構域在調節植物的生物學功能中起著至關重要的作用，盡管大多數已知的鋅指蛋白都是轉錄調節因子，但它們也可以參與染色質重塑，RNA 結合或蛋白-蛋白相互作用這些生物學過程［62］。即使是經典的C2H2鋅指基序也不能只簡單地看作是核酸結合基序，還要看到其完成除DNA、RNA 識別和包裝之外的其他功能［23］。

目前該轉錄因子研究主要體現在克隆及定位分析、組織表達特異性及脅迫條件下的表達規律、轉基因植株的抗逆性檢測等［7，63］，對鋅指蛋白除基本逆境脅迫的信號傳導及轉錄因子間的相互作用機制等方面研究較少，如該轉錄因子通過哪些途徑、以何種方式調控下游基因表達、與其它轉錄因子相互作用的方式及原理等。隨著分子生物學的發展和研究水平的提升，以及對該轉錄因子的研究更加深入全面，有望在利用鋅指蛋白基因資源改良及培育新品種中發揮重要作用。