熱帶芳香觀賞蘭花香花毛蘭的組培快繁技術①

席會鵬 葛 奇 李佳蔚

(中國科學院西雙版納熱帶植物園 云南勐臘666303)

熱帶蘭花引種栽培始于18 世紀，目前已廣泛應用于盆花、切花、配餐花與香料等方面［1-2］。中國云南與海南等省份是熱帶蘭花重要的產地，其中蝴蝶蘭及大花惠蘭系列已成為非常重要的觀賞花卉品種［3-5］。香氣是構成蘭花觀賞價值的重要因素，但目前栽培應用的熱帶蘭花品種多不具有香味，多以花色繁多、花朵碩大、花形奇特及花期長為特點［6-7］。因此，培育芳香型品種已成為熱帶蘭花育種的趨勢之一。

香花毛蘭（Eria javanica）主產于亞洲熱帶地區，我國多見于云南南部，花期8～10月，花多數，生于長達50 cm 花序軸上，花色白，香氣清新，開花時的氣質符合中國傳統對于蘭花“色清”“氣清”的審美追求，具有重要的觀賞栽培價值，是一個正待開發的芳香型蘭花種。然而，香花毛蘭植株生長周期長，無性繁殖困難，傳統的分株繁殖的繁殖系數極低。人工有性繁殖在自然狀態下也難以萌發，因此傳統繁殖技術難以大量繁殖。并且，野生香花毛蘭主要生于海拔300～1 000 m的林中，多為附生或半附生，由于生存環境的特殊性，全球氣候變化與人類活動干擾導致野生附生蘭花已急劇減少［8-11］。鑒于香花毛蘭的觀賞價值與擴繁需求，及嚴峻的野外資源現狀，通過植株組織培養建立香花毛蘭繁殖體系迫在眉睫，進而系統化、高效化、快速化繁殖，不受季節與氣候等自然因素限制的條件下，短期內獲得大量植株，推進該物種的開發利用與保護。

目前，組織快繁已對多種蘭花進行大規模的克隆繁殖，不僅減輕了對野生蘭花植物采集壓力，而且可以獲得大量優良種苗。組織培養的研究重點在于優化培養條件，其中培養基成分的優化方面，關注點集中到基本培養基的選擇［12-14］，激素配比［15-16］及不同有機成分的添加［17］。

對于毛蘭屬植物的組培快繁，現有研究主要是針對足莖毛蘭。王蓮輝等［18］在足莖毛蘭的組培快繁研究中，以原球莖為外植體探究不同種類的有機添加物對其的影響，并對適宜足莖毛蘭增殖生長和生根生長的培養基進行探索。其結果表明：在足莖毛蘭的組培快繁研究中，有機添加物10%的椰子汁對原球莖的誘導有極顯著影響；激素組合6-BA 和NAA 及配比10∶1 時對芽的誘導和增殖起明顯的促進作用；一定濃度的IBA對足莖毛蘭的壯苗生根起關鍵性作用；栽培基質的選擇極大地影響足莖毛蘭的移栽成活率。

對于香花毛蘭的組培，仍然缺少報道。本研究對香花毛蘭叢生芽的增殖、生根壯苗過程進行了重點研究，通過對最優基本培養基、最佳有機添加物、激素濃度配比及N、P、K元素等影響因素進行研究，探索并優化香花毛蘭組培快繁技術，以期為香花毛蘭的開發利用與保護提供理論與實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香花毛蘭的種子采自中國科學院西雙版納熱帶植物園種苗組蘭科植物資源圃中，試驗在中國科學院西雙版納熱帶植物園種苗組組培室中進行。以八九成熟的自交蒴果作為外植體進行無菌播種，播種培養基為MS＋香蕉50 g/L＋土豆50 g/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂粉4.0 g/L＋AC1.0 g/L。并在該播種培養基上獲得無菌苗。選取無污染、生長健壯、長勢一致的無菌苗，切除根、側芽及長勢較弱的葉片后，作為各處理的試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 不同基本培養基對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

用香花毛蘭無菌苗作為試驗材料，每瓶10株，每個處理各10 瓶，重復3 次。采用KC、VW、Mi‐tra、MS、全半量1/2MS、部分半量1/2MS 6 種的不同基本培養基，培養100 d 后測量并統計新根數、新芽數、株高、根長、根粗。

1.2.2 不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

以Mitra培養基作為基本培養基，用香花毛蘭無菌苗作為試驗材料，每瓶10 株，每個處理各10瓶，重復3次。采用10%香蕉、10%洋芋、10%椰子汁3 種不同的有機添加物，培養100 d 后測量并統計新根數、新芽數、株高、根長、根粗。

1.2.3 6-BA 與NAA 的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養的影響

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L為基本培養基，比較6-BA和NAA 2 種外源激素的不同濃度配比對香花毛蘭無菌苗增殖生長產生的影響，每種外源激素各設0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 4 個濃度梯度，并以空白作對照。將處理好的無菌苗接種至不同培養基中，每瓶10株，每個處理各10瓶，重復3次，培養120 d 后測量并統計新根數、新芽數、株高、根長、根粗。

1.2.4 6-BA 與IBA 的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養的影響

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L為基本培養基，比較6-BA和IBA 2 種外源激素的不同濃度配比對香花毛蘭無菌苗生根生長產生的影響，6-BA 設有0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4個濃度梯度，IBA設有0.02、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/L 5 個濃度梯度，并以空白作對照。將處理好的無菌苗接種至不同培養基中，每瓶10 株，每個處理各10 瓶，重復3 次，培養120 d后測量、統計新根數、新芽數、株高、莖粗、根長、根粗。

1.2.5 改良Mitra基本培養基對香花毛蘭壯苗生根的影響

以Mitra培養基為基本培養基，單獨加倍培養基中N、P、K元素含量，比較其對香花毛蘭生長產生的影響。將處理好的無菌苗接種至不同培養基中，每瓶10 株，每個處理各10 瓶，重復3 次，培養100 d 后測量、統計新根數、新芽數、株高、莖粗、根長、根粗。

1.2.6 煉苗移栽

移栽前首先要將組培瓶移入煉苗室內，每天早10 點至下午17 點用60%遮陰度的遮陽網遮陽，持續30 d；煉苗后將苗取出，洗凈根上的培養基，用多菌靈3 g/L＋硫磺鏈霉素1 g/L的溶液浸泡消毒10 min，晾干，移栽入組培盤內。

1.2.7 培養方式及培養條件

所有培養瓶均用650 mL蘭花瓶，增殖培養基每瓶分裝75 mL，壯苗生根培養基每瓶分裝100 mL，pH均為5.8。材料均置于（25±2）℃和18 00～2 500 lx光照條件下培養，每天均需用日光燈照明12 h。

1.2.8 數據處理

運用SPSS 19.0 進行方差分析，其中方差分析方法采用的是單因素方差分析和雙因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，并采用標記字母法將多重比較的結果清楚地表達出來。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

對比不同基本培養基對香花毛蘭叢生芽根數、根長、根粗、芽數及株高指標的影響，發現Mitra培養基中生根數量最多，所發新根最長、最粗，且與其余5組之間均存在顯著性差異；1/2 MS全半量培養基中所發新芽顯著多于其余各組，但株高與最佳MS 培養基不存在顯著性差異；MS 培養基中植株株高與KC 培養基存在顯著性差異，與其余組不存在顯著性差異（圖1）。但從生長表現來看，KC 培養基和VW 培養基中生長的無菌苗均存在不同程度的褐化現象；MS培養基、1/2 MS部分半量培養基中生長的無菌苗根部均存在不同程度的變異現象。因此，香花毛蘭增殖基本培養基為1/2MS全半量培養基；壯苗生根基本培養基為Mitra培養基。

2.2 不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

對比不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽根數、根長、根粗、芽數及株高項指標的影響，發現加入香蕉、椰子汁以及沒有加入任何添加物的培養基中無菌苗所發新根的根數、根長、根粗顯著高于加入土豆的培養基，加入椰子汁的培養基中其3項指標均顯著高于加入香蕉及無添加物的培養基；加入椰子汁的芽數顯著高于其余3種處理，加入香蕉與無添加培養基之間的芽數不存在顯著差異，均高于加入洋芋的芽數；加入椰子汁的株高顯著高于其余3 種處理。因此，添加10%椰子汁的培養基均有利于香花毛蘭的增殖與壯苗生根（圖2）。

2.3 6-BA 與NAA 的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養的影響

由表1可知，在香花毛蘭叢生芽增殖培養過程中，6-BA的獨立作用對根數、根長、芽數、株高4個因素的影響存在極顯著差異，對根粗的影響存在顯著性差異，對莖粗的影響不存在顯著性差異；NAA的獨立作用對香花毛蘭增殖培養中根數、根長、根粗、芽數、株高六個因素的影響存在極顯著差異；6-BA與NAA的交互作用對香花毛蘭增殖培養中對根數影響不存在顯著性差異，對根長、根粗、芽數、株高四個因素的影響存在極顯著差異。

6-BA 濃度為0.1 mg/L 與NAA 濃度為0.5 mg/L、6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 、6-BA濃度為0.5 mg/L與NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為0.5 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 四組濃度配比對根數的影響顯著優于其余各組，其中6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 時生根數量最多（圖3a、3b）。當6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L、6-BA 濃度為0.5 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L 與NAA 濃度為2.0 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L 與NAA濃度為2.0 mg/L時對根粗的影響優于其余各濃度配比（圖3c、3d）。當NAA 濃度一定時，6-BA 濃度對根長的影響會隨6-BA 濃度的增大而增強，到一定峰值后又會隨著其濃度的增大而減弱；當NAA濃度為0.1 mg/L與6-BA 濃度為0.5 mg/L 或1.0 mg/L 時顯著優于其余各組（圖3e，3f）。在香花毛蘭叢生芽增殖過程培養中當NAA 濃度為1.0 mg/L 時，6-BA 濃度為0.5 mg/L對芽數的影響最大（圖3g、3h）。株高的大小會隨6-BA 與NAA 濃度配比的大小變化而變化，并在6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為0.1 mg/L 時達到最大，6-BA 濃度為0.2 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時次之（圖3i、3j）。因此，6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時為香花毛蘭叢生芽增殖最佳激素組合。

表1 6-BA與NAA的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養的雙因素方差分析

2.4 6-BA 與IBA的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養的影響

由表2可知，6-BA的獨立作用在香花毛蘭壯苗生根培養中，對根數、根粗、芽數三個因素的影響均存在極顯著差異；對根長、株高因素的影響均不存在顯著性差異。IBA 的獨立作用在香花毛蘭壯苗生根培養中，對根數、芽數因素的影響均不存在顯著性差異；對株高的影響存在極顯著差異；對根長、根粗兩個因素的影響均存在顯著性差異。6-BA 與IBA 的交互作用在香花毛蘭壯苗生根培養中，對根長的影響不存在顯著性差異；對根數、根粗三個因素的影響存在顯著性差異；對芽數、株高兩個因素的影響存在極顯著差異。

表2 6-BA與IBA的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養的雙因素方差分析

在香花毛蘭生根培養中，當6-BA 濃度為0 與IBA 濃度為0.6 mg/L、6-BA 濃度為0.1 mg/L 與IBA濃度為0.02 mg/L、6-BA 濃度為0.1 mg/L 與IBA 濃度為0.2 mg/L 時，生根數量與6-BA 濃度為0、IBA濃度為0.4 mg/L 時有一定差距，但是生根數量均較多，且與其余各濃度配比相比存在顯著的優勢（圖4a、4b）。當6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.6 mg/L 時，所發新根根長最長，且大于空白對照組，其余各濃度配比根長或等于或小于空白對照組，作用效果均劣于6-BA（圖4c、4d）。當6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.6 mg/L 時，所發新根最粗壯、結實，并顯著優于其余各濃度配比（圖4e、4f）。當6-BA濃度為0時，芽數的大小隨IBA濃度的變化而變化，并在濃度為0.4 mg/L 時取得最值，濃度為0.6 mg/L 時次之，濃度為1.0 mg/L 再次之（圖4g、4h）。當6-BA 濃 度為0.1 mg/L、IBA 濃 度 為0.02 mg/L 時，株高取得最大值，但與6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.4 mg/L 時、6-BA 濃度為0.5 mg/L、IBA 濃 度 為0.6 mg/L 時、6-BA 濃 度 為1.0 mg/L、IBA 濃度為0.6 mg/L 時無顯著差異（圖4i、4j）。因此，IBA 濃度為0.4 mg/L 時為香花毛蘭壯苗生根最佳激素組合。

2.5 改良Mitra基本培養基對香花毛蘭壯苗生根的影響

改變Mitra 培養基中N、P、K 元素含量（含量加倍），發現對照組（Mitra）會使葉色泛黃的問題稍微得到緩解，原因可能是經過轉接無菌苗的生長發育狀況會發生一定的改觀；加入一定量的N元素能夠明顯改善Mitra基本培養基中香花毛蘭葉色普遍泛黃的問題，葉片變得濃綠有光澤，使幼苗生長更加健壯；加入一定量的P、K 元素不會使葉色發生明顯的改變（表3，圖5）。因此，改良Mitra 基本培養基時應加入一定量的N 元素以利于其生長。

3 討論與結論

關于香花毛蘭組培快繁的研究目前仍為缺乏［18］。本研究探討其叢生芽的增值，誘導壯苗生根過程中最佳培養基配比方案，實驗結果發現，相較KC、VW、MS、與部分半量1/2 MS，全半量1/2 MS 培養基為最適宜香花毛蘭叢生芽增殖基本培養基；Mitra 培養基為最適宜香花毛蘭壯苗生根的基本培養基；并且對比該培養基添加了香蕉、洋芋后，添加椰子汁的培養基更有利于其生長，這與王蓮輝等［18］研究足莖毛蘭組培快繁過程中獲得結果一致。

控制激素濃度的實驗發現，在香花毛蘭增殖培養過程中6-BA 和NAA 都具有一定的促進作用，但6-BA 對其增殖生長的影響大于NAA 對其增殖生長的影響，并得出當6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時效果最好，且實際操作過程中也發現當6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L時幼苗所發側芽最多、生長最健壯。因此，最適合香花毛蘭叢生芽增殖生長的激素濃度配比為：6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L。在香花毛蘭的壯苗生根培養中，IBA 對根數、根長、根粗的影響較為顯著，起主導作用，6-BA 對其影響較小，起輔助作用，加入6-BA 并沒有對香花毛蘭的生根生長起到顯著性作用。并得出當6-BA 濃度為0 mg/L、IBA濃度為0.4 mg/L 時，幼苗生長狀況最好。與實際操作過程中所得結果一致。

最適宜香花毛蘭叢生芽增殖的培養基配方為：1/2 MS 全半量＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 1.0 mg/L＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；最適宜香花毛蘭壯苗生根的培養基配方為：Mitra＋NH4NO30.83 g/L＋IBA 0.4 mg/L ＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；改良培養基中加入N元素更有利于香花毛蘭葉色由黃綠轉變為濃綠。

表3 改良Mitra基本培養基對香花毛蘭壯苗生根的影響

本研究中快繁體系還存在有待改進之處，如在基本培養基的篩選試驗過程中，發現MS、全半量1/2 MS、部分半量1/2 MS培養基中幼苗根部出現繞頸的“自殺式”生長，通過比較正常生長的Mitra 培養基中的元素含量發現三者的元素含量普遍偏高，所以其根部的這種生長現象可能與培養基中的元素含量有關。在有機添加物的試驗過程中，僅簡單考慮了相同量不同有機添加物之間的差異，而沒有考慮幾種有機添加物共同作用對香花毛蘭生長的影響。