新疆巴州地區奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析

馬 博 卜三平 周鴻淼 王艷萍 劉 鴿

1.巴音郭楞職業技術學院，新疆庫爾勒841000；2.新疆維吾爾自治區畜牧總站，烏魯木齊830000

奶牛乳房炎（mastitis）也稱乳腺炎，是泌乳牛乳腺細胞受到化學、物理和致病微生物等多種因素影響而產生的一種炎癥反應，是奶牛場中常見的疾病之一，嚴重影響奶牛場的經濟效益。根據有無臨床癥狀和患病的嚴重程度，分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎，臨床型乳房炎常伴有紅、腫、熱、痛癥狀。引起奶牛乳房炎的細菌種類眾多，約150 種[1-5]，3 種最為常見的致奶牛乳房炎致病菌為大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌。研究[6-10]證明，金黃色葡萄球菌的危害最大，金黃色葡萄球菌可產生致熱性外毒素、殺白細胞素、腸毒素、剝脫毒素、溶血毒素和中毒性休克綜合癥毒素等，容易引起奶牛乳腺組織不可修復的損傷；導致金黃色葡萄球菌引起的乳房炎治愈率低的另一個重要因素是金黃色葡萄球菌易對抗生素產生耐藥性[11-13]。分子生物學在21世紀的生命科學領域占有重要位置，其中的聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術是一種在體外擴增目的DNA 片段的技術，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便（2 d左右）、取材方便等諸多優點，在細菌檢測中應用廣泛[14]。本文主要針對新疆巴州地區庫爾勒市、輪臺縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規模化奶牛場奶牛隱性乳房炎做抽樣調查，從患隱性乳房炎奶牛的乳汁中分離鑒定金黃色葡萄球菌，分別從金黃色葡萄球菌的形態學、生物化學、分子水平等方面鑒定巴州八縣一市規模化養殖場的奶牛隱性乳房炎的金黃色葡萄球菌的陽性率，并進行了部分耐藥性分析，為控制奶牛隱性乳房炎的發病率和奶產量下降提供科學的理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）樣品來源。分別從巴州地區庫爾勒市、輪臺縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規模化奶牛場各抽檢200 頭泌乳奶牛的800 份乳樣，共計7 200 份乳樣（200 頭/區域×9 個區域×4 乳區/頭=7 200 個乳樣）。抽檢的奶牛全為澳系的荷斯坦泌乳奶牛。

2）主要儀器。超凈工作臺、恒溫箱（青島）、磁力加熱攪拌器（78-1 型）、PCR 儀（TC-512）、高速冷凍離心機（Multifuge X1R）、凝膠成像儀（Bio-Rad）、電泳槽（Power Wave XS2）、電泳儀（DYY-6B）、50 mL乳樣收集管、蒸餾水瓶、乳房炎診斷盤等。

3）主要試劑。蘭州隱性乳房炎診斷試劑（LMT）、蒸餾水、瓊脂糖、革蘭氏快速染色液、TaqDNA 聚合酶、DL-2000 DNA Marker（大連）、細菌基因組DNA提取試劑盒（北京睿博興科生物）；普通營養瓊脂培養基、鮮血培養基、金黃色葡萄球菌選擇性培養基（也稱高鹽甘露醇培養基）、甘露醇發酵試驗生化鑒定培養基、麥芽糖培養基、葡萄糖培養基、蔗糖培養基、乳糖培養基、兔鮮血培養基[15-18]（配方中均按加100 mL 蒸餾水計算，如需要更多，可以根據倍數關系成倍增加配方中的其他物質，但pH 不能改變）；丁胺卡那、卡那霉素、多西環素、恩諾沙星、環丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環素12 種抗生素。

①金黃色葡萄球菌選擇性培養基：牛肉膏粉末0.2 g、蛋白胨2.0 g、D-甘露醇2.0 g、氯化鈉3.0 g、瓊脂粉末3.0 g、酚紅0.005 g，充分攪拌搖勻，調節pH至7.4，放121 ℃高壓滅菌20 min。

②LB 液體培養基：在錐形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水100 mL，將混合物搖勻，調節培養基的pH 在7.4～7.6 范圍內。如混合物溶解不好，可用電熱套適當加熱，121 ℃高壓滅菌20 min。

③LB 固體培養基：在錐形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水100 mL，將混合物搖勻，調節培養基的pH 在7.4～7.6 范圍內，加入瓊脂粉1.8 g。將錐形瓶密封好后，放高壓鍋121 ℃高壓環境下滅菌20 min，可即時分裝試管（已經高壓滅菌過），將試管立于斜面上，使培養基降溫后成斜面；也可放好備用，但需要將LB 固體培養基在電熱套上加熱，使之完全溶解，倒LB 固體培養基過程中要注意無菌操作。

④鄧亨氏水：稱蛋白胨2.0 g、氯化鈉1.0 g，調節pH 至7.6，以備配制其他培養基使用。

⑤麥芽糖培養基：稱麥芽糖2.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑥葡萄糖培養基：稱葡萄糖粉1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑦蔗糖培養基：稱量蔗糖1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑧乳糖培養基：稱乳糖1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑨兔鮮血培養基：采集兔血5～10 mL（常用心臟采血法，根據倒平板的多少來定），在注射器中提前抽取一定量的自配抗凝劑，采集血量要滿足抗凝劑的比例為5%，將兔鮮血和抗凝劑的混合物加入高壓滅菌好的LB 固體培養基中（溫度不宜太高，否則會使兔血變成暗紅色，溫度40～50 ℃為宜），搖勻，在已經用紫外線消毒好的凈化工作臺內倒入平板。

1.2 試驗方法

1）隱性乳房炎的檢測及奶樣的采集。隨機從巴州地區的八縣一市規模化養殖場各抽檢200 頭奶牛，共1 800 頭奶牛的7 200 個乳區乳樣，使用LMT（圖1）進行隱性乳房炎的檢測，以此確定八縣一市奶牛隱性乳房炎發病率。整體方案是采用現場采集乳樣、現場檢測的方法，將被檢乳樣為陽性的做好標記。具體采集乳樣的方法為：使用干凈棉質溫熱毛巾將預采樣的奶牛乳房和乳頭擦拭干凈，注意換洗毛巾，保持清洗桶內水的干凈清澈，使用0.5%碘伏溶液對乳頭藥浴1 min 左右，使用75%的酒精噴灑整個乳房，將碘伏溶液沖洗干凈，使用衛生紙將乳房和乳頭擦拭干凈，擠掉前3 把奶后，將50 mL 乳樣收集管置于奶牛乳房下并收集滿待檢乳樣，擠奶過程防止污染收集管；將待檢乳樣20 mL 左右倒入檢測盤的檢測杯內，將檢測盤傾斜，棄去多余乳汁，使檢測杯內留下約2 mL 乳樣，再將稀釋好的LMT 2 mL 擠入每個檢測杯中，水平同心圓搖動35 s，使乳樣與LMT 充分混合，根據混合物的沉淀情況確定待檢乳樣的乳房炎陰陽性，見圖2。取待檢乳樣LMT 陽性的乳樣2 mL 于高壓處理的EP管內，-20 ℃保存備用。

2）金黃色葡萄球菌的分離、純化培養。分別蘸取LMT 陽性的乳樣到普通營養肉湯培養基中，置37 ℃恒溫箱中培養24 h。在金黃色葡萄球菌選擇性平板培養基上劃線接種培養，置37 ℃恒溫箱中18～24 h[19]。金黃色葡萄球菌選擇性培養基上菌落生長良好時，在經紫外線照射消毒好的超凈工作臺中使用接種環挑取單個典型菌落，在兔鮮血培養基上劃線培養，37 ℃恒溫箱中培養18～24 h。革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌體的染色特性和形態。將鏡檢為金黃色葡萄球菌的菌落接種到金黃色葡萄球菌液體培養基中培養，起到增殖的目的。

圖1 蘭州隱性乳房炎診斷試劑（LMT）

圖2 在檢測盤中使用（LMT）檢測乳樣

3）金黃色葡萄球菌的生化鑒定。對培養的待檢細菌分離、純化、培養后，進行生化鑒定：血漿凝固酶試驗、過氧化氫酶試驗、蔗糖發酵試驗、麥芽糖發酵試驗、乳糖發酵試驗、甘露醇發酵試驗，對照《常見細菌系統鑒定手冊》，觀察試驗結果[20-24]。

4）金黃色葡萄球菌的16S rRNA 鑒定。參考16S rRNA 基因測序法，完成16SrDNAPCR擴增。上游引物為：5’-CGAAAGCCTGACGGAGCAAC-3’；下游引物為：5’-AACCTTGCGGTCGTACTCCC-3’（六合華大基因科技合成）。參照細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取金黃色葡萄球菌菌株的基因組DNA。以基因組DNA 為模板擴增16S rRNA基因，PCR 法采用20 μL 反應體系：ddH2O 8 μL，PCR Mix 8 μL，模板2 μL，上、下游引物均1.0 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。

5）金黃色葡萄球菌的耐藥性分析。使用藥敏紙片進行藥敏試驗，對丁胺卡那、卡那霉素、多西環素、恩諾沙星、環丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環素12 種抗生素進行耐藥性試驗，判定標準見表1。

表1 耐藥性試驗判定標準

2 結果與分析

2.1 乳樣LMT 檢測結果

巴州地區八縣一市規模化養殖場1 800 頭奶牛中隱性乳房炎奶牛頭數為432 頭，患病率為24%（432/1 800），具體見表2；432 頭隱性乳房炎奶牛的1 728 個乳區中有1 296 個患乳房炎陽性乳區，乳區患病率為18%（1 296/7 200）。

表2 巴州地區八縣一市抽檢奶牛乳房炎發病率

2.2 金黃色葡萄球菌菌株的分離與鑒定

37 ℃恒溫培養24 h，乳房炎陽性分離菌株在普通肉湯培養基上和兔鮮血瓊脂培養基上均生長良好。觀察在兔鮮血瓊脂培養基上金黃色葡萄球菌生長的形態特征為圓形、灰白色，表面光滑、隆起、濕潤，菌落周圍有β 溶血現象（圖3）。在普通瓊脂培養基上培養，菌落生長良好，形態特征為圓形、表面光滑、隆起、濕潤、菌落邊緣整齊，直徑大小為1.0～2.5 mm 的菌落。在金黃色葡萄球菌選擇性培養基上培養，菌落形態為圓形、黃色、濕潤、邊緣整齊（圖4）。分離菌革蘭氏染色后鏡檢，觀察到圓形、革蘭陽性，有的呈單個，有的呈短鏈狀，還有的呈現出葡萄串的形狀（圖5）。

圖3 血平板生長情況

圖4 甘露醇生長情況

圖5 顯微鏡觀察情況

2.3 生化鑒定結果

進行生化鑒定的試驗結果：過氧化氫酶試驗、血漿凝固酶試驗全都為陽性，可發酵蔗糖、麥芽糖、甘露醇。按照《常見細菌系統鑒定手冊》的相關知識，將分離到的菌與之對照，分離細菌的生化鑒定結果符合金黃色葡萄球菌的生化鑒定，試驗結果判定52 株分離菌都是金黃色葡萄球菌。

2.4 分離株的16S rRNA 擴增

對52 株奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離株引物擴增16S rRNA 基因后，分離菌株均得到了大小為528 bp 的目的片段（圖6）。

圖6 金黃色葡萄球菌16S rRNA PCR 擴增

2.5 分離株的藥敏結果

52 株金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、環丙沙星的耐藥率為100%，對阿莫西林的耐藥率為80.8%（42/52），對慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐的耐藥率為5.7%（3/52），對多西環素、克林霉素、四環素的耐藥率0%（0/52）。并出現了25 株菌多重耐藥性，所占比例為48%（25/52）。

3 討論

對新疆巴州地區庫爾勒市、輪臺縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規模化奶牛場各抽檢200 頭泌乳奶牛的800份乳樣，共計1 800 頭奶牛、7 200 份乳樣。1 800頭奶牛中隱性乳房炎奶牛數為432 頭，患病率為24%（432/1 800），而其他多個奶牛場的金黃色葡萄球菌致奶牛乳房炎發病率為30%以上[25-27]。雖然相對偏低，但也證實存在金黃色致病菌感染的病例，應引起畜牧工作者的高度重視。432 頭隱性乳房炎奶牛的1 728 個乳區中有1 296 個患乳房炎陽性乳區，乳區患病率為18%（1 296/7 200）。對患隱性乳房炎的奶牛乳樣進行金黃色葡萄球菌的分離和形態學、生物化學、分子水平等方面鑒定，共分離得到52 株金黃色葡萄球菌。

試驗分離到的52 株金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、環丙沙星的耐藥率為100%，對阿莫西林的耐藥率為80.8%（42/52），對慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐的耐藥率為5.7%（3/52），對多西環素、克林霉素、四環素的耐藥率為0%（0/52）。并出現了25 株菌多重耐藥性，所占比例為48%（25/52），說明耐藥性在細菌病的治療過程中是非常普遍的現象[28]。治療奶牛場中患乳房炎奶牛仍以抗生素療法為主，這引起了致病細菌耐藥性的問題和乳制品食品安全問題；針對細菌耐藥性問題，可以嘗試使用中草藥、抗菌肽、噬菌體等無抗療法。研究發現，金黃色葡萄球菌致病力的強弱主要與其產生的侵襲性酶類和各種毒素有關[29]。

引發奶牛乳房炎的因素是多方面的，主要分致病菌因素、管理因素和遺傳因素。不同地區引發奶牛乳房炎的致病菌的種類存在差異，但鏈球菌、腸桿菌和金黃色葡萄球菌仍是主要的致病菌。而多數金黃色葡萄球菌菌株都攜帶腸毒素基因，嚴重影響奶牛乳腺細胞正常的生理功能[30-32]。金黃色葡萄球菌極易產生耐藥性，疫苗生物制劑是預防金黃色葡萄球菌乳房炎的重要手段；治療金黃色葡萄球菌乳房炎也需要一些像抗菌肽、中草藥和噬菌體等新型的無抗生素治療方案，有效避免細菌產生耐藥性，把好乳源食品安全關。飼養管理不當容易導致奶牛養殖環境的溫度、濕度、通風等不適，從而引發致病菌的滋生；擠奶廳的擠奶操作不規范，極易導致奶牛乳區受傷，引發致病菌從傷口感染乳區的情況出現；營養不良或者不均衡也是導致奶牛乳房炎一個重要的致病因素[33]。從臨床數據發現，患乳房炎的奶牛的雌性后代的乳房炎患病率明顯偏高，存在遺傳物質的影響。飼養環境對奶牛乳房炎的影響較大，應做好奶牛場的管理工作。同時，采用某一種或者多種致病菌的單苗或者多價苗進行免疫預防，是預防奶牛乳房炎的重要方法；搞好奶牛飼養圈舍和運動場的環境消毒工作非常重要，要制定針對本飼養場的消毒計劃和使用行之有效的消毒藥品；及時將患乳房炎的奶牛與其它健康的奶牛隔離飼養，積極治療患病奶牛，及時淘汰生產性能較低且患病的奶牛。

奶牛乳房炎歷史悠久，盡管生物技術在21世紀得到了不斷發展，仍很難徹底解決奶牛乳房炎問題[34]；有研究人員通過生物技術利用金黃色葡萄球菌產生的毒素、莢膜和侵襲性酶等細胞因子或者結構正在努力嘗試研發多種亞單位疫苗，用于奶牛乳房炎的預防[35]。