高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方斑蝥膠囊中4 種活性成分含量

白 宏，何光照

（江蘇省常州市第四人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 常州 213032）

復(fù)方斑蝥膠囊是以斑蝥、人參、黃芪、刺五加、三棱、半枝蓮、莪術(shù)、山茱萸、女貞子、熊膽粉、甘草等藥材經(jīng)煎煮等工序加工制成的中成藥，具有破血消瘀、攻毒蝕瘡之功效，臨床主要用于治療原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、婦科惡性腫瘤[1－3]。方中刺五加益氣健脾、補(bǔ)腎安神[4－5]，山茱萸補(bǔ)益肝腎、收澀固脫[6－7]，女貞子滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)[8－9]，甘草補(bǔ)脾益氣、清熱解毒[10－11]。復(fù)方斑蝥膠囊收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十七冊(cè)）》（WS3－B－3272－98），標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀、鑒別、檢查項(xiàng)，無(wú)針對(duì)方中中藥成分的含量測(cè)定項(xiàng)；加強(qiáng)對(duì)復(fù)方斑蝥膠囊藥物的質(zhì)量控制，可有效保障廣大人民群眾的用藥安全，遏制不法分子制假、販假行為[12－13]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方斑蝥膠囊中馬錢苷、特女貞苷、紫丁香苷和甘草苷4 種活性成分含量。現(xiàn)報(bào)道如下。QUINTIX2102－1CN 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；UV－8000A 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器公司）；Milli－Q IQ 7000 型超純水儀（美國(guó)密理博公司）；KQ2200ES 型超聲波清洗器（昆山超聲設(shè)備公司，功率為500 W，頻率為100 kHz）。

1 儀器與試藥

儀器：安捷倫1260 型高效液相色譜儀，配備G1311C型四元泵、G1329B 型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 型柱溫箱和G1314F 型紫外檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；Sartorius

試藥：馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)為111640－201808，含量為99.0% ），特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)為111926－201605，含量為93.3% ），紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)為111574－201605，含量為95.2%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610－201106，含量為93.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方斑蝥膠囊（陜西華西制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20003270，批號(hào)分別為180924，190106，190417，規(guī)格為每粒0.25 g）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；磷酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑廠）；純化水（自制）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclispe Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A） －0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～8 min 時(shí)5%A，8 ～15 min 時(shí)5% ～23%A，15 ～28 min 時(shí)23% ～73%A，28 ～29 min時(shí)73% ～5%A，29 ～35 min 時(shí)5%A）。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液配制

混合對(duì)照品貯備溶液：取馬錢苷、特女貞苷、紫丁香苷、甘草苷對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，制備每1 mL 溶液中含馬錢苷0.5 mg、特女貞苷2.5 mg、紫丁香苷0.8 mg、甘草苷2.0 mg 的混合溶液，加85%甲醇20 mL 使溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：精密量取混合對(duì)照品貯備溶液2.0 mL，置20 mL 容量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品20 粒，倒出內(nèi)容物，混勻，取約1.0 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加85%甲醇20 mL，超聲提取25 min（超聲功率為300 W，頻率為25 kHz），放冷，加85%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方分別制備缺刺五加、山茱萸、女貞子、甘草的陰性樣品，以及缺待測(cè)成分對(duì)應(yīng)藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取試劑空白溶液及2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在4 種待測(cè)成分馬錢苷、紫丁香苷、甘草苷、特女貞苷對(duì)應(yīng)色譜峰位置無(wú)雜質(zhì)干擾，4 種待測(cè)成分分離度均符合《中國(guó)藥典》要求。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液適量，稀釋制成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別置20 mL 容量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件設(shè)置儀器參數(shù)，穩(wěn)定后分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4 種活性成分線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果馬錢苷、紫丁香苷、甘草苷、特女貞苷峰面積的RSD分別為1.34%，1.42%，1.19%，0.94%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180924）20 粒，倒出內(nèi)容物，混勻，取約1.0 g，精密稱定，共6 份，分別置25 mL容量瓶中，依法制備供試品溶液；按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算含量。結(jié)果馬錢苷、紫丁香苷、甘草苷和特女貞苷含量的RSD分別為2.08%，2.81%，3.39%，1.93%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為180924），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置0，3，6，9，12，24 h，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果馬錢苷、紫丁香苷、甘草苷和特女貞苷峰面積的RSD分別為1.48%，2.03%，1.82%，1.08%（n ＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為180924）20 粒，倒出內(nèi)容物，混勻，取約1.0 g，精密稱定，共6 份，分別置25 mL 容量瓶中；加入2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液適量，依法制備供試品溶液；按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為180924，190106，190417），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3 批樣品中4 種活性成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 活性成分選擇

考察復(fù)方斑蝥膠囊中刺五加、山茱萸、甘草、女貞子4 味藥材的指標(biāo)性成分，即紫丁香苷、馬錢苷、甘草苷和特女貞苷，基本覆蓋了復(fù)方斑蝥膠囊組方中的君臣佐使，能全面地反映其質(zhì)量。

3.2 提取方法優(yōu)化

試驗(yàn)分別優(yōu)化了提取溶劑的用量（15，18，20，22 mL）、超聲時(shí)間（15，20，25，30 min）和功率（250，300，350 W）。結(jié)果表明，選擇85% 甲醇提取溶劑用量為20 mL、超聲時(shí)間25 min 和超聲功率300 W 時(shí)，提取效率最好，且雜質(zhì)無(wú)干擾。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別配制5 μg／mL 的紫丁香苷、馬錢苷、甘草苷和特女貞苷單標(biāo)對(duì)照品溶液，于190 ～400 nm 波長(zhǎng)間進(jìn)行波譜掃描，記錄光譜圖。結(jié)果紫丁香苷在262 nm 波長(zhǎng)處、馬錢苷在241 nm 波長(zhǎng)處、甘草苷在237 nm 波長(zhǎng)處、特女貞苷在225 nm 波長(zhǎng)處具有最大吸收。表明選擇235 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，4 種活性成分響應(yīng)情況良好，定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC 檢測(cè)復(fù)方斑蝥膠囊中4 種活性成分馬錢苷、特女貞苷、紫丁香苷、甘草苷的含量，簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方斑蝥膠囊的質(zhì)量控制。