頂空氣相色譜法檢測他達(dá)拉非原料藥中4 種溶劑殘留量

張繼東，盧 江，張世應(yīng)，唐 靜，楊瑞玲，孫緒舉△

（1. 華中科技大學(xué)醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430074； 2. 湖北省武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430077）

他達(dá)拉非片是環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）特異性磷酸二酯酶5（PDE5）的選擇性可逆抑制劑[1－2]，可抑制PDE5，使陰莖海綿體內(nèi)cGMP 水平提高，平滑肌松弛，使血液流入陰莖組織，從而使其勃起。作為勃起功能障礙的治療藥物，他達(dá)拉非持續(xù)時間較西地那非更長、耐受性更好，同樣對心血管、肺動脈有擴(kuò)張作用，也可作為肺動脈高壓的治療藥物。他達(dá)拉非有多條合成路線，合成中主要用到甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等有機(jī)溶劑。2015年版《中國藥典（一部）》[3]并未收載他達(dá)拉非有機(jī)溶劑的檢測方法。因此，本研究中采用頂空氣相色譜技術(shù)[4－8]測定他達(dá)拉非原料藥中的甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃溶劑的殘留量。現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 氣相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國惠普公司）；Agilent 7890A 型氣相色譜儀配備頂空自動進(jìn)樣器（美國安捷倫公司）；XS205 型分析天平（瑞士梅特勒公司，精度為0.01 mg）；Milli－Q 型純水器（美國Milli Pore 科技公司）。

1.2 試藥

二甲基亞砜（DMSO，SIGMA 試劑有限公司，批號為C10268951）；甲醇、乙腈均為色譜純（美國TEDIA 試劑公司）；異丙醇、四氫呋喃為分析純（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑廠）；他達(dá)拉非原料藥（湖北鑫潤德化工有限公司，批號分別為171596－29－5，171596－29－6，171596－29－7）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DB－624 柱（30 m ×0.53 mm，3.0 μm）；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；分流比：5 ∶1；檢測器：FID，檢測器溫度為250℃；載氣：高純氮?dú)猓兌葹?9.999%；流速：1.8 mL ／min；程序升溫方式：初始溫度60 ℃，保持4 min，然后以20 ℃／min 的速率升至200 ℃，保持8 min；頂空瓶：平衡溫度為90 ℃，平衡時間為40 min，傳輸管溫度為100 ℃，定量環(huán)溫度為110 ℃。對照品溶液色譜圖中4 種殘留溶劑峰的理論板數(shù)均不低于5000，且分離度均大于1.5。

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取甲醇300 mg、乙腈41 mg、異丙醇300 mg、四氫呋喃72 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：精密量對照品貯備液1，2.5，5，10，20，25 mL，分別置50 mL 容量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。臨進(jìn)樣前精密量取系列對照品溶液各5 mL，置20 mL 頂空瓶中密封，待進(jìn)樣。

供試品溶液：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入5 mL 二甲基亞砜使溶解，密封，即得。

空白溶液：精密移取5 mL 二甲基亞砜，置20 mL 頂空瓶中，密封，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：精密量取2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃主峰的保留時間處均無干擾峰。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取對照品溶液，注入氣相色譜系統(tǒng)。以各殘留溶劑的峰面積響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)、對應(yīng)對照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃4 種溶劑的線性回歸方程。詳見表1。

表1 4 種溶劑殘留線性關(guān)系考察結(jié)果

檢測限與定量限確定：根據(jù)甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃4 種殘留溶劑的儀器響應(yīng)情況，逐步稀釋對照品溶液，以信噪比（S／ N）＝10 ∶1 對應(yīng)的濃度作為各溶劑的定量限，S／ N＝3 ∶1 對應(yīng)的濃度作為殘留溶劑的檢測限。4 種溶劑的檢測限及定量限見表2。

表2 4 種溶劑的檢測限與定量限（μg／mL）

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，同法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂氣相色譜條件頂空進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，同法精密稱取6 份樣品，分別精密移取已知質(zhì)量濃度（甲醇0.6 mg／mL、乙腈0.082 mg／mL、異丙醇0.6 mg／mL 和四氫呋喃0.144 mg／mL）的對照品溶液各5 mL，置已預(yù)先加入0.5 g 樣品的20 mL 頂空瓶中，共配制3 個加標(biāo)濃度。按擬訂氣相色譜條件測定，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果見表4。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（%，n ＝6）

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n ＝3）

2.4 殘留溶劑含量測定

依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件頂空進(jìn)樣，測試3 批他達(dá)拉非樣品中的溶劑殘留量。結(jié)果3 批樣品均未檢出乙腈、異丙醇，其中2 批均有檢出甲醇和四氫呋喃，1 批只檢出甲醇；1 批次四氫呋喃超標(biāo)（《中國藥典（四部）》規(guī)定不超過0.072%），分析生產(chǎn)工藝可能由于樣品重結(jié)晶后烘干工藝不穩(wěn)定而導(dǎo)致樣品中殘留溶劑四氫呋喃超標(biāo)。詳見表5。

表5 殘留溶劑含量測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 溶劑篩選

用純化水溶解時，因他達(dá)拉非原料藥不溶于水，樣品浮于純化水上，待測溶劑不能很好地溶于純化水中，對樣品中甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃的檢測準(zhǔn)確性有一定影響，重復(fù)性也不符合2015年版《中國藥典（二部）》對殘留溶劑重復(fù)性的要求。本研究中采用二甲基亞砜溶劑溶解樣品，他達(dá)拉非樣品完全溶于二甲基亞砜，且4 種殘留溶劑的對照品溶液以二甲基亞砜作為溶劑，其穩(wěn)定性也比水更好。故選擇二甲基亞砜作為本次測試方法的溶劑。

3.2 程序升溫考察

考察了初始柱溫分別為50，60，70 ℃對各溶劑色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始柱溫為50 ℃時，4 種溶劑出峰后移且乙腈和異丙醇分離度小于1.5；初始柱溫為60 ℃時，色譜峰峰型較好且分離度大于1.5；初始柱溫為70 ℃時甲醇峰出峰較早且拖尾嚴(yán)重。綜合考慮，初始柱溫設(shè)為60 ℃。

3.3 頂空進(jìn)樣條件考察

頂空瓶加熱溫度考察：保持其他頂空條件不變，分別考察頂空瓶保溫溫度為60，70，80，90，100 ℃時對待測溶劑測定結(jié)果的影響。結(jié)果設(shè)定頂空瓶保溫溫度分別為60，70，80，90 ℃時，各溶劑峰面積逐漸增大，設(shè)定頂空瓶保溫溫度為100 ℃時，各溶劑峰面積與90 ℃時基本一致，故試驗(yàn)設(shè)定保溫溫度為90 ℃。

頂空瓶保溫時間考察：保持其他頂空條件不變，分別設(shè)定頂空瓶保溫時間為20，30，40，50，60 min 時對待測溶劑峰面積的影響。結(jié)果設(shè)定頂空瓶保溫時間分別為20，30，40 min 時，待測溶劑的峰面積逐漸增大；設(shè)定頂空瓶保溫時間分別為50，60 min 時，與40 min 對應(yīng)的待測溶劑峰面積基本一致，表明保溫時間設(shè)定在40 min內(nèi)不夠，未將樣品中待測溶劑完全分離出來，故試驗(yàn)設(shè)定頂空瓶保溫時間為40 min。

綜上所述，本研究中建立的測定他達(dá)拉非中甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃溶劑殘留量的檢測方法，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，且操作簡便快速，可為他達(dá)拉非的質(zhì)量控制提供參考。