水晶蘭苷對破骨細胞生成的抑制作用*

王宥涵，賀寶榮，2△

（1. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2. 西安交通大學附屬紅會醫院脊柱外科，陜西 西安 710054）

破骨細胞（OC）可參與骨質疏松癥、類風濕關節炎、骨性關節炎、脊柱椎間融合釘棒內固定術后螺釘周圍由炎性反應導致的骨溶解等多種疾病的病理進展[1－4]，作為一類具有骨吸收功能的多核細胞，其可參與人體骨量調節。破骨細胞起源于造血系統中的單核巨噬細胞系，這類細胞在經過巨噬細胞集落刺激因子（M－CSF）、核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）和一系列細胞因子的復合調節作用下，逐漸分化為具有骨吸收功能的成熟破骨細胞。活化T－細胞核因子1（NFATc1）作為破骨細胞分化過程中的主要下游靶點，調節多種破骨細胞特異性基因的表達，后者與破骨細胞細胞膜上的相應受體結合，正向促進破骨細胞的生成。GU 等[5]的研究表明，在缺乏NFATc1 的小鼠模型中常見嚴重的骨硬化表現。此外，NFATc1 表達水平的上調還能促進破骨細胞的生成，并加強骨吸收活性。傳統中藥巴戟天是茜草科巴戟天屬植物巴戟天Morinda officinalis的干燥根，經現代藥理學分析，其主要活性成分包括環烯醚萜類、蒽醌類和低聚糖化合物等[6]。其中，環烯醚萜類成分水晶蘭苷為巴戟天的有效成分[7]，能抑制去卵巢大鼠模型中骨量減少，其可能具有抑制破骨細胞生成的能力[8－9]。本研究中通過建立體外破骨細胞的培養系，觀察了水晶蘭苷抑制破骨細胞生成的作用，并通過測定水晶蘭苷對NFATc1 的表達水平，探討了可能作用的靶點。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：IX73 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Applied Biosystems 7500 型實時熒光定量聚合酶鏈反應系統（qPCR，美國Applied Biosystems 公司）；UV－2550型紫外分光光度計（日本Shimadzu 公司）；TGL－27M 型臺式高速冷凍離心機（上海高致精密儀器有限公司）；BS124S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 mg）。

試藥：水晶蘭苷（成都瑞芬思生物科技公司，純度為98.67%，批號為S－036－171216）；MTT 試劑盒（美國Sigma－Aldrich 公司，批號為M5655）；TRAP 染色盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號為HR9064）；10% 胎牛血清（批號為10099－141），DMEM 培養基（批號為31600034），均購自美國Gibco 公司。

細胞：RAW264.7 細胞系（美國典型培養物保藏中心，ATCC，批號為ATCC.SC－6003）。

1.2 方法

細胞培養及分組[10－11]：A 組、B 組、C 組、D 組分別以3×105個／mL RAW264.7 細胞系接種于含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中，均添加35 ng／mL 的RANKL 和30 ng／mL 的M－CSF；除A 組外，B 組、C組、D 組分別添加10，20，50 μmol／L 水晶蘭苷藥液，置37 ℃及5%CO2、飽和濕度的培養箱中，連續培養3 d，以上每孔設8 組平行樣。

細胞毒性檢測：采用3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法評估藥物的細胞毒性。取適量上述各組細胞并置96 孔板中，每孔加入MTT 溶液，孵育4 h。棄反應液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO），充分溶解結晶物，置分光光度計中，于490 nm波長處測定光密度（OD值），記錄數據。

破骨細胞生成數目檢測：培養3 d 后，在光鏡下觀察破骨細胞生成數目，觀察到巨大空泡細胞且細胞核數目不少于3 個的細胞即為破骨細胞，加入TRAP 染色劑，置CO2培養箱中孵育1 h，快速置光鏡下統計細胞核數量不少于3 個的細胞數目，并記錄數據。

破骨細胞中NFATc1 的mRNA 表達水平檢測：提取各組細胞中的RNA，置光度儀中，于260 nm 和280 nm波長處測定RNA 的純度和濃度，保證比值在1.9 ～2.0間。合成cDNA 第一鏈，并進行PCR 體外擴增。引物序列為，NFATc1（5′－CTCGAAAGACAGCACTGGAGCAT－3′和5′－CGGCTGCCTTCCGTCTCATAG－3′），GAPDH（5′－TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG－3′和5′－AGTGGGAGT TGCTGTTGAAGT－3′）。95 ℃失活RNase 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，循環30 次；獨立重復3 次。

破骨細胞中NFATc1 蛋白水平表達檢測：取上述數量細胞提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，繪制標準曲線，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）跑膠，濕轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，按說明書比例稀釋一抗并孵育過夜，隨后孵育二抗，常規顯色，置掃膜儀下測定。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計學軟件分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

MTT 和TRAP 染色結果見表1。NFATc1 的mRNA和蛋白表達水平見圖1 和圖2。

表1 各組RAW264.7 細胞OD 值、TRAP 染色（＋）細胞數目比較（±s，n ＝8）

表1 各組RAW264.7 細胞OD 值、TRAP 染色（＋）細胞數目比較（±s，n ＝8）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，＃P ＜0.05；與C 組相比，＆P ＜0.05。

組別A 組B 組C 組D 組質量濃度（mmol／L）0 10 20 50 OD 值1.28±0.06 1.25±0.07 1.25±0.05 1.26±0.05 TRAP 染色（＋）細胞數目（個）132.10 ±11.28 87.88 ±8.52*50.38 ±11.78*＃25.88 ±7.81*＃＆

圖1 給藥后不同濃度下NFATc1 的mRNA 表達水平

3 討論

正常骨組織的代謝是由成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收組成，生理狀態下，兩者此消彼長，相互制約，最終達到動態平衡[12]。對骨質疏松癥患者局部骨組織進行活檢發現，破骨細胞較成骨細胞不僅在數目和活性上占優勢，且明顯高于非骨質疏松癥患者[13]。可見，破骨細胞的異常活躍與骨吸收功能亢進是導致骨量丟失的重要因素。破骨細胞是許多骨丟失性疾病中重要的分子生物學基礎，破骨細胞的生成與骨吸收效果的體現是多種細胞因子復合起效的結果[14]。破骨細胞的生成需與成骨細胞相接觸，成骨細胞通過釋放M－CSF和RANKL 調節破骨細胞的繁殖、分化、并存[15]。RANKL可作為重要的起始因素參與到破骨細胞生成環節[16]。巴戟天主要成分水晶蘭苷具有抗氧化[17]、抗感染[18]等生物學活性，ZHANG 等[8]的研究指出，其在體內試驗中可降低RANKL 的表達水平，并預防去卵巢小鼠的骨丟失作用。本試驗中通過RANKL 誘導的RAW264.7 細胞系發現，在無其他干預存在的空白對照組中，由RAW264.7 分化而來的破骨細胞明顯增多，而水晶蘭苷能在一定程度上減少RANKL 誘導產生的破骨細胞數目。并且結合MTT 實驗的結果分析，水晶蘭苷對破骨細胞生成的抑制效果不是由于藥物細胞毒性而產生的。

圖2 給藥后不同濃度下NFATc1 的蛋白質表達水平

OUYANG 等[19]研究指出，破骨細胞的分化經由胞內RANKL 介導信號通路，該通路的中下游信號點位包含了腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、激活蛋白1（AP－1）、核因子κB（NF－κB）等，刺激信號經瀑布級聯的方式傳導至NFATc1 這一終末靶點。由NFATc1 激活的破骨細胞能大量正反饋調節如NF－κB、TRAP、組織蛋白酶（CTSK）、基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）、破骨細胞相關受體（OSCAR）、樹突狀細胞－特異性跨膜蛋白（DCSTAMP）、ATP 酶VO 結構域d2 亞型（atpv0d2）和原癌基因（c－Src）及其底物酪氨酸激酶底物5／5 個SH3 結構域（TKS5／FISH）等破骨細胞相關的分化、功能因子[20]。可見，NFATc1 對于破骨細胞的活性有重要的調節作用[21]。本試驗中通過RANKL 誘導RAW264.7 細胞系發現，給予一定濃度的水晶蘭苷后，在限定濃度范圍內，隨著水晶蘭苷藥物濃度的升高，mRNA 表達水平逐漸降低，且在WB 試驗中也觀察到NFATc1 的蛋白表達量隨著藥物濃度升高而逐漸降低。結合TRAP 染色結果分析，NFATc1 表達水平的下降可能與水晶蘭苷抑制破骨細胞分化生成有關。

綜上所述，有關水晶蘭苷對破骨細胞生成的調節作用雖在分子生物學層面有一定的進展，但本試驗中暴露出的問題也應引起注意。目前體外試驗顯示，水晶蘭苷對破骨細胞的分化具有抑制作用，仍缺乏水晶蘭苷在體內試驗中抑制破骨細胞活性的直接證據。故仍需進行更細致和系統的試驗設計。另外，鑒于破骨細胞特異性基因的種類繁多，且調控機制也較復雜，關于NFATc1 介導的破骨細胞特異性產物是如何調節破骨細胞生成的，仍有待進一步探究。