褪黑激素對精神分裂癥小鼠行為及氧化應激的影響

潘小平，李國成

（1. 廣西壯族自治區百色市第二人民醫院，廣西 百色 533000； 2. 廣西壯族自治區腦科醫院，廣西 柳州 545505）

精神分裂癥是一種復雜的神經精神疾病，與多巴胺、膽堿能和谷氨酸能等神經遞質系統的功能障礙有關，導致大腦生化和臨床表型的改變[1]。大量研究表明，抗氧化防御系統的崩潰與精神分裂癥密切相關[2]。目前，常用N－甲基－D－天冬氨酸谷氨酸受體（NMDA－R）拮抗劑如地卓西平（MK－801）、氯胺酮和苯環利定的藥理學模型對精神分裂癥進行動物機制研究[3]。重復使用MK－801 與自主活動增加、社交退縮和記憶喪失等一系列行為改變相關，曾報道與氧化狀態的變化有關[4]。MK－801的使用與大腦所有區域谷胱甘肽（GSH）／脂質過氧化和髓過氧化物酶活性的增加相關[5]。多巴胺拮抗劑如利培酮能有效逆轉精神分裂癥患者陽性癥狀，但無法改善其認知障礙、社交退縮及與代謝紊亂相關的預期壽命下降[6]。非典型抗精神病藥物可治療精神分裂癥的陽性和陰性癥狀，但無明確證據表明其比利培酮更有效或耐受性更好[7]。研究表明，褪黑素參與了精神分裂癥的發病過程[8]，精神分裂癥、晝夜節律障礙和精神分裂癥患者褪黑激素水平的關系[9]。褪黑素也被用于控制精神分裂癥相關的睡眠障礙和藥物相關的遲發性運動障礙，但其治療精神分裂癥的作用機制尚不清楚[10]。本研究中通過腹腔注射MK－801 誘導小鼠精神分裂癥模型，并給予褪黑素進行干預，以探討褪黑激素通過對大腦氧化應激的影響，發揮減輕精神分裂癥模型小鼠行為異常的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Sunrise 型全自動酶標儀（瑞士Tecan 公司）；曠場實驗設備（北京金盛恒星醫療器械公司）；Morris 水迷宮裝置及DigBehv 動物行為分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）。

試藥：褪黑素和地卓西平馬來酸鹽（MK－801，美國Sigma 公司，批號分別為M5250 和1001799365）；利培酮（北京天衡藥物研究院南陽天衡制藥廠，批號為06－140602）；丙二醛（MDA）試劑盒（批號為A020－2－2），谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號為A005－1－2），均購自南京建成生物工程研究所；一氧化氮（NO）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號為ml076941）。

動物：40 只C57BL／6 小鼠，河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（冀）2012－0002。

1.2 方法

動物模型制備、分組與給藥：選擇40 只體質量在25 ～30 g 的雄性C57BL／6 小鼠，于22 ～24 ℃、相對濕度為40% ～70%、晝夜循環（12 h／12 h）的SPF 環境中自由進食和飲水，適應性喂養1 周后進行試驗。按隨機數字表法將小鼠均分為對照組、模型組、利培酮組和褪黑素組，各10 只。模型組、利培酮組和褪黑素組小鼠均給予腹腔注射MK－801（0.1 mg／kg），建模成功標準參考SAMS－DODD 刻板行為評分標準[11]；對照組腹腔注射生理鹽水（0.1 mg／kg），選擇小鼠左或右（每日交叉）下側腹部進行注射，連續注射直至試驗結束。第15 天開始，利培酮組小鼠灌胃給予利培酮（0.025 mg／kg），褪黑素組小鼠灌胃給予褪黑素（5 mg／kg）[12]，對照組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水，連續14 d 后進行相關試驗。

社會交往測試：第21 天，將小鼠置大小為100 cm×100 cm ×40 cm 的社交測試箱內進行適應，每天適應5 min，第28 天給藥結束后將模型組、利培酮組和褪黑素組小鼠與對照組小鼠進行兩兩配對，通過測試箱頂部安裝的攝像頭對小鼠的社交行為進行記錄并分析。測試時間為7 min，社交行為分為非攻擊性行為（與同伴嗅聞、尾隨、社交性玩耍、理毛）和攻擊性行為（與同伴踢打、摔跤或打架），計算社交時間與測試時間的比值（%）。

曠場測試：所有小鼠做完社會交往測試后在安靜的房間內將小鼠放入曠場實驗設備的中心方格內，記錄小鼠在10 min 內穿越格子的次數。

Morris 水迷宮測試：第1 ～14 天，小鼠在Morris 水迷宮內自由游泳以適應環境，第21 天開始對小鼠進行連續7 d 的水迷宮訓練，在末次給藥后進行水迷宮測試。

氧化應激指標測定：所有小鼠在做完行為測試后第2 天脊髓脫臼處死，分離腦組織，用玻璃勻漿器將腦組織在冰冷的磷酸鹽緩沖液中勻漿（1 ∶10，W ／ V），在5 000 r／min（4 ℃）下離心15 min，取上清液，根據試劑盒說明書分別檢測MDA，GSH，NO 的含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0 統計學軟件分析。計量資料以均數±標準差（）表示，行單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK－q檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠社交時間和跨格總數

與對照組比較，模型組、利培酮組和褪黑素組小鼠社交時間減少，跨格總數增加（P ＜0.05）；與模型組比較，利培酮組和褪黑素組小鼠社交時間增加，跨格總數降低（P ＜0.05）；利培酮組和褪黑素組小鼠社交時間和跨格總數差異不顯著（P ＞0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠社交時間和跨格總數比較（±s，n ＝10）

表1 各組小鼠社交時間和跨格總數比較（±s，n ＝10）

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與模型組相比，bP ＜0.05。下表同。

組別對照組模型組利培酮組褪黑素組社交時間（s）62.42±5.61 14.98±2.13a 46.64 ±4.14ab 44.15 ±2.24ab跨格總數（次）232.50±28.64 348.27±19.20a 299.26 ±16.34ab 302.39 ±41.28ab

2.2 小鼠學習記憶能力

與對照組比較，模型組、利培酮組和褪黑素組小鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數顯著減少（P ＜0.05）；與模型組相比，利培酮組和褪黑素組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數顯著增多（P ＜0.05）；利培酮組和褪黑素組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數差異不顯著（P ＞0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠學習記憶能力比較（±s，n ＝10）

表2 各組小鼠學習記憶能力比較（±s，n ＝10）

組別對照組模型組利培酮組褪黑素組逃避潛伏期（s）21.20±3.14 47.19±5.30a 34.46±4.08ab 37.48±6.50ab穿越平臺次數（次）5.31 ±0.65 2.07±0.54a 3.86±1.23ab 4.01±0.64ab

2.3 小鼠腦組織中MDA，GSH，NO 含量

與對照組比較，模型組、利培酮組和褪黑素組小鼠腦組織中MDA 和NO 含量顯著升高，GSH 含量顯著降低（P ＜0.05）；與模型組相比，利培酮組和褪黑素組小鼠腦組織中MDA 和NO 含量顯著降低，GSH 含量顯著增高（P ＜0.05）；利培酮組和褪黑素組小鼠腦組織中MDA，GSH，NO 含量差異不顯著（P ＞0.05）。詳見表3。

表3 各組小鼠腦組織中MDA，GSH，NO 含量比較（X±s，n ＝10）

3 討論

外源性褪黑激素的作用已被廣泛研究。患者白天服用褪黑素可促進睡眠，并在海馬區形成類似睡眠的大腦活動模型；外源性褪黑激素在嚙齒類動物中有抗驚厥、抗焦慮、抗抑郁、促進記憶的作用[12]。褪黑素對逆轉MK－801 誘導的小鼠精神分裂癥相關行為和生化變化有好處[12]，明確了褪黑激素作為人類精神分裂癥治療輔助手段的有效性，但關于其作為唯一藥物的潛在臨床前信息仍然匱乏。MK－801 通過NMDA－R 的拮抗作用誘導精神分裂癥樣癥狀，通過抑制γ－氨基丁酸（GABA）能神經元，導致谷氨酸和多巴胺的可用性增加，導致激發（過度運動）[13]。本研究中以重復給予NMDA－R 受體拮抗劑MK－801 建立了精神分裂癥動物模型。利培酮是一種多巴胺（D2）和5－羥色胺（5HT）2A受體拮抗劑，由于對5－HT2A和α1－腎上腺素能受體的強效拮抗作用，具有抵抗MK－801 誘導的過度運動能力，還可通過增加海馬乙酰膽堿的釋放、內側前額葉皮層中乙酰膽堿或多巴胺濃度，以抵消MK－801 誘導的記憶喪失，逆轉與MK－801 給藥相關的社交或工作記憶缺陷[14]。褪黑素具有中樞抑制作用（減少運動和梳理毛發），對運動的影響的可能原因是其在神經遞質系統中恢復同步的能力，這可能會導致興奮性和抑制性神經遞質活動之間恢復平衡[15]。褪黑激素對大腦具有抗興奮作用，其抗驚厥作用與褪黑激素促進GABA 的傳遞有關，增強GABA 能直接抵消MK－801 對谷氨酸和多巴胺的影響[16]。褪黑激素的記憶增強作用是通過對神經細胞黏附分子（NCAM）的影響，導致重塑突觸連接的能力增強而實現的[17]。本研究結果顯示，褪黑素具有中樞抑制作用，可減少開放領域的行為和增加社交能力，改善小鼠的學習記憶能力，抑制小鼠腦部的氧化應激狀況。

精神分裂癥中存在氧化損傷，氧化損傷也與預后有關，MK－801 對大腦抗氧化狀態的影響與PAWETCZYK 等[18]的研究結果一致。MK－801 給藥導致抗氧化活性的改變，GSH 減少，NO 和MDA（脂質過氧化指數）水平增加[19]。給予利培酮能逆轉氯胺酮誘導的氧化應激，褪黑素能增加大腦GSH 活性，并降低腦MDA 和NO 水平[20]。褪黑素的抗氧化作用能增加GSH過氧化物酶和還原酶的活性，刺激抗氧化酶清除自由基和中和活性氧／氮物種。褪黑素對脂質過氧化的影響歸因于其中和引發脂質過氧化的毒性反應物（LOOH）的能力。褪黑素還對NO 有親和力，其易于滲透到亞細胞區室中，誘導內皮細胞損傷和凋亡[21]。與標準抗精神病藥利培酮相比，褪黑素也具有一定的抗氧化作用，提示其有助于改善與精神分裂癥發病相關的氧化應激。

綜上所述，褪黑素能逆轉MK－801 引起的行為變化，其效果與利培酮相當，其作用可能與阻斷大腦氧化應激反應有關，可能成為治療精神分裂癥的藥物和／或輔助治療藥物，但仍需更多的研究來證明其可作為精神分裂癥治療的潛在藥物。