珠芽景天不同部位提取物抗小鼠急性肝損傷的作用研究*

吳瑩瑩，李 銀，馬 雪，鄭 林，姚成芬，李勇軍，林昌虎△

（1. 貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2. 貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004； 3. 貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004）

珠芽景天為景天科景天屬植物珠芽景天Sedum bulbiferum Makino的干燥全草，廣泛分布于廣東、廣西、湖南、四川、貴州等省，主要生長于貴州道真、畢節、清鎮等地區，是貴州省民間常用藥材。文獻記載其用于治療食積腹痛、風濕癱瘓、寒熱瘧疾等癥[1－3]。目前，已分離出黃酮類、生物堿、多糖、三萜類、礦質元素[4－8]等多種化學成分。本課題組在前期進行了珠芽景天的化學成分分離研究[9]，發現珠芽景天中含多種黃酮類成分。黃酮類化合物是一類具有多種生物學活性的天然產物，具有抗炎[10]、抗氧化[11]、抗病毒[12]等藥理活性，在防治肝臟疾病等方面發揮著重要作用[13]。《湖南藥物志》記載，珠芽景天可用于治療慢性肝炎[14]。目前，國內外對珠芽景天的保肝活性研究尚未見報道。本研究中以經典的四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型進行試驗，通過觀察小鼠血清和肝組織中相關生化指標的變化、肝組織病理變化，對珠芽景天保肝有效部位進行篩選，為全面開發利用珠芽景天提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

1.1.1 儀器院孫慶文教授鑒定為景天科景天屬植物珠芽景天Se-dum bulbiferum Makino的干燥全草。D101 凈品型大孔樹脂（天津農藥股份有限公司樹脂分公司）；CCl4（分析純，上海申博化工有限公司，批號為20151214）；金龍魚玉米油（益海嘉里食品營銷有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（貴州科倫藥業有限公司，批號為E118072407）；甲醛溶液（分析純，重慶江川化工有限公司，批號為20170221）；75%乙醇（分析純，四川金山制藥有限公司，批號為20170221）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20180423）；雙環醇片（北京協和藥廠，批號為180402）；羧甲基纖維素鈉（成都金山化學試劑有限公司，批號為20151123）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒、天門冬酸氨基轉移酶（AST）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 動物

SPF 級KM 小鼠，120 只，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2014－0011。適應性飼養1 周，飼養于溫度為（22±2）℃、相對濕度為45% ～60%的動物房內。

UV －2700 型紫外可見分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；Varioskan LUX 型全波長酶標儀（美國Thermo 公司）；Multifuge X3R 型高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；BCD－258WDPM 型冰箱（青島海爾股份有限公司）；BSM 220.4 型電子天平（上海卓精電子科技有限公司，精度為萬分之一）；IMS－20型制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；XW－80A 型漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫用儀器廠）；KZ－20L 型超純水機（上海科制環保設備有限公司）；十字柄玻璃組織勻漿器（南通市衛寧實驗器材有限公司）。

1.1.2 試藥

珠芽景天藥材采自于貴州省清鎮市，經貴陽中醫學

1.2 方法

1.2.1 珠芽景天不同極性組分制備

取干燥的珠芽景天藥材1 kg，以70%乙醇回流提取2 次，第1 次10 倍量體積提取2 h，第2 次8 倍量體積提取1.5 h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑得浸膏150 g。將D101 凈品型大孔吸附樹脂用乙醇浸泡24 h，2 倍柱體積乙醇洗滌后，3 倍柱體積水洗，備用。浸膏加水溶解，上柱，依次用水、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，回收各部分洗脫液，并濃縮成干浸膏，得水洗脫部位60 g，50%乙醇洗脫部位37 g，95%乙醇洗脫部位9 g，備用。

1.2.2 分組、造模及給藥

將KM 小鼠隨機分為12 組，每組10 只，分別為正常對照組、模型組、雙環醇組（陽性對照組，0.2 g／kg），以及水段高、中、低劑量組（以生藥量計分別為16.38，10.92，5.46 g／kg），50%乙醇段高、中、低劑量組（以生藥量計分別為10.08，6.72，3.36 g／kg），95%乙醇段高、中、低劑量組（以生藥量計分別為2.46，1.64，0.82 g／kg）。正常對照組和模型組小鼠給予0.5%羧甲基纖維素鈉，其余組小鼠分別給予相應藥物，每天1 次，連續灌胃7 d，末次給藥2 h 后。正常對照組小鼠腹腔注射玉米油10 mL／kg，其余各組小鼠均按10 mL／kg 體質量腹腔注射0.1% CCl4玉米油混合液制備急性肝損傷模型。造模后，禁食不禁飲，成模16 h 后摘取小鼠眼球，取血，頸椎脫臼處死小鼠，并分離小鼠肝臟組織，備用。

1.3 觀察指標

ALT 及AST 的檢測：將采集的小鼠全血室溫下靜置1 ～2 h，3 500 r／min 離心10 min，取上層血清備用。按試劑盒說明書操作檢測血清中ALT 和AST 的活性。

肝臟MDA 含量檢測：取小鼠肝臟0.2 g，置1.8 mL生理鹽水中，冰水浴條件下勻漿，制成10%肝勻漿溶液，3 000 r／min 離心10 min，取上清液備用。先按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，得到蛋白濃度，再按MDA試劑盒說明書操作，根據公式計算MDA 含量。

肝組織病理切片：將新鮮小鼠肝臟置10%甲醛固定，切成0.2 ～0.5 cm 薄片，用70% ～100%乙醇梯 度洗脫、二甲苯透明處理、石蠟包埋，制成厚約3 μm 的薄片。二甲苯脫蠟，蘇木精－伊紅（HE）染色，脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察肝組織切片的病理學變化。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠血清ALT 和AST 及肝組織MDA 含量

結果見表1。與正常對照組比較，模型組小鼠ALT和AST 活性顯著升高（P ＜0.01），表明急性肝損傷模型復制成功；與模型組比較，雙環醇組和珠芽景天50%乙醇段中、高劑量組CCl4所引起的ALT 和AST 活性升高均明顯降低（P ＜0.05）。與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織MDA 含量顯著升高（P ＜0.01）；與模型組比較，雙環醇組和珠芽景天50% 乙醇段中、高劑量組MDA 含量顯著降低（P ＜0.05）。

表1 珠芽景天對CCl4 致小鼠急性肝損傷血清ALT，AST 及肝組織MDA 含量的影響（±s，n ＝10）

表1 珠芽景天對CCl4 致小鼠急性肝損傷血清ALT，AST 及肝組織MDA 含量的影響（±s，n ＝10）

注：與正常對照組比較，△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別正常對照組模型組雙環醇組水段 高劑量組中劑量組低劑量組50%乙醇段 高劑量組中劑量組低劑量組95%乙醇段 高劑量組中劑量組低劑量組劑量（g／kg）0.20 16.38 10.92 5.46 10.08 6.72 3.36 2.46 1.64 0.82 ALT（U／L）36.09±7.42 177.84±19.75△59.03±15.19**173.09±19.88 161.11±33.67 167.44±11.49 103.59±33.26**148.50±30.59*165.38±10.65 167.23±5.56 169.55±23.45 158.78±18.53 AST（U／L）46.33±28.58 151.35±30.81△86.95±23.08**143.74±17.63 140.05±33.78 157.96±23.69 94.08±32.97**104.37±40.24**119.59±38.71*141.71±37.77 147.88±29.35 143.47±30.42 MDA（nmol／mL）1.47±0.4 2.27±0.48△1.41±0.43**1.95±0.49 2.34±0.40 1.86±0.94 1.73±0.33**1.80±0.30*2.37±0.36 2.22±0.42 2.19±0.28 2.33±0.44

2.2 肝損傷模型小鼠肝組織形態學觀察

圖1 珠芽景天對CCl4 致小鼠急性肝損傷肝臟病理學的影響（HE，×200）

結果見圖1。正常對照組小鼠肝細胞結構清晰，肝細胞核大而圓，核仁明顯，核膜清晰，無細胞變性壞死；與正常對照組比較，模型組肝細胞變性壞死，肝細胞腫脹較明顯，大量炎性細胞產生，說明CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型復制成功；雙環醇組和給藥組較模型組雖仍有部分病變，但炎性細胞減少，肝小葉結構較完整，排列整齊，表明雙環醇組和珠芽景天50%乙醇段高、中、低劑量組均對CCl4誘導小鼠急性肝損傷具有一定保護作用。

3 討論

通過高效液相色譜及提取物重量分析，珠芽景天提取物的水、50%乙醇、95%乙醇洗脫部位基本無交叉，分段效果較好，各部分含有的化學成分不相同，可用該方法進行珠芽景天不同部位提取物對急性肝損傷模型小鼠的保護作用研究。對各洗脫部位的化學成分分析表明，50%乙醇洗脫部位中主含黃酮類成分，提示珠芽景天50%乙醇洗脫部位的保肝活性與黃酮類物質密切相關。

CCl4急性肝損傷模型是經典的化學性肝損傷模型，是研究保肝活性試驗的首選模型。CCl4在肝臟生成三氯甲基自由基，導致肝細胞微粒體膜脂質過氧化，致肝細胞受損[15]。胞質內ALT 和AST 大量釋放進入血液，使血液中ALT 和AST 活性升高[16－17]，故血清ALT 和AST一定程度上能反映肝臟的損傷程度[18]。造模時選擇0.1%和0.2% CCl4玉米油溶液，按10 mL／kg 體質量腹腔注射造模[19]，結果表明，0.1%和0.2% CCl4玉米油溶液均能引起小鼠血清ALT 和AST 升高，升高程度呈明顯的劑量依賴性，考慮過高劑量會引起動物死亡，故選擇0.1% CCl4。結果表明，模型組較正常對照組小鼠血清ALT 和AST 活性顯著升高，結合組織病理切片檢查，表明CCl4所致小鼠急性肝損傷模型復制成功。參考文獻[20]，結合預試驗考察結果，在0.1%劑量的CCl4玉米油溶液處理后16 h 血清轉氨酶水平達峰值，小鼠肝損傷程度較合適、肝損傷模型穩定，較易反映藥物的保肝降酶作用，因此選擇建立模型后16 h 為測定轉氨酶水平的時間點。

根據臨床劑量及試驗結果，選擇提取物干浸膏能溶解于羧甲基纖維素鈉的最大量（約臨床劑量的60 倍）作為給藥劑量，結果表明，保肝效果明顯，和模型組相比差異有統計學意義。故本試驗的給藥劑量設計為以珠芽景天臨床劑量的60 倍、40 倍和20 倍。

本研究結果顯示，珠芽景天50%乙醇段對CCl4誘導小鼠急性肝損傷有保護作用，與模型組比較，珠芽景天50%乙醇段小鼠血清中ALT 和AST 活性明顯降低（P ＜0.05）。MDA 可反映體內脂質過氧化的程度及細胞損傷情況。與模型組比較，珠芽景天50%乙醇段高、中劑量組小鼠肝臟MDA 含量明顯降低（P ＜0.05）。結合病理切片檢查結果，可見珠芽景天50%乙醇段對CCl4致小鼠急性肝損傷有保護作用，可為珠芽景天化學成分和物質基礎的研究提供參考。