新型冠狀病毒滅活方式對高效液相色譜法監測萬古霉素血藥濃度的影響

張曉旭，侯林中，姜 暉，張倩影，繳萬里，劉曉紅△

（1. 河北省唐山市工人醫院藥學部，河北 唐山 063000； 2. 河北省唐山中心醫院藥學部，河北 唐山 063000；3. 華北理工大學附屬醫院藥學部，河北 唐山 063000）

新型冠狀病毒肺炎（COVID－19）疫情自2019年12月暴發以來迅速蔓延至全球，截至2020年3月24日，全球COVID－19 患者已逾37 萬例[1]。新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）為β 屬冠狀病毒，顆粒呈圓形或橢圓形并有包膜，其與蝙蝠嚴重急性呼吸綜合征（SARS）樣冠狀病毒（bat－SL－CoVZC45）同源性超過85%[2]；對紫外線和熱敏感，56 ℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑可有效滅活病毒[3]。

現有數據基本證實，SARS－CoV－2 可經呼吸道飛沫、消化道和接觸傳播，且有傳染性，COVID－19 臨床表現多樣，病情反復多變[4]。COVID－19 目前以對癥治療為主，沒有特效藥[3]。COVID－19 重型患者一般較輕型患者合并更多基礎疾病，同時可能合并細菌、真菌感染，用藥方案復雜，應通過治療藥物監測（TDM）優化用藥[5]。COVID－19 重癥患者的治療方案中，糖肽類抗菌藥物萬古霉素為常用藥，相關指南建議需監測其血藥濃度[6]。萬古霉素血藥濃度的監測方法有微生物法、酶放大免疫法（EMIT）、熒光偏振免疫法，以及更常用、專屬性強、準確度高及成本低的高效液相色譜（HPLC）法[7]。

對于SARS－CoV－2 的滅活方式，TDM 標本可考慮采用56 ℃30 min 水浴加熱樣本，亦可考慮采用短波紫外線處理樣本進一步保證病毒滅活效果[8]。前期研究顯示，經水浴56 ℃加熱30 min 處理后，不會影響免疫法監測萬古霉素的血藥濃度[8]，但濕熱滅活及紫外滅活對HPLC 法監測萬古霉素血藥濃度的影響尚未見研究報道。本研究中考察了SARS－CoV－2 不同滅活方式對HPLC 法監測萬古霉素血藥濃度的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1200 型高效液相色譜儀，包括G1329A 型自動進樣器、G1311A 型四元泵、G1315D 型二極管陣列檢測器和G1316A 型柱溫箱（美國Agilent 公司）。萬古霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量100%，批號130360－200301）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為實驗室自制超純水。健康人血清（唐山市工人醫院檢驗科提供）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC － C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2% 三乙胺緩沖液（磷酸調pH 至3.2） －甲醇（15 ∶85，V／ V）；流速：1.2 mL／min；檢測波長：236 nm；柱溫：40 ℃。外標法計算得萬古霉素血藥濃度。

1.2.2 樣品采集與制備

血樣：選取唐山市定點醫院—— 唐山市傳染病醫院收治的COVID－19 患者2 例（患者1，男，64 歲；患者2，女，67 歲），靜脈滴注萬古霉素（12 h 1 g，8 h 0.7 g），直至其達穩態血藥濃度（半衰期約6 h，至少4 個固定劑量）[9]。下次給藥前30 min 內抽取患者靜脈血3 ～5 mL，置紅帽頭普通采血管中，3 500 r ／ min 離心10 min，吸取血清300 μL（空白人血清270 μL ＋萬古霉素質控液30 μL），加入沉淀劑10%高氯酸100 μL，渦旋振蕩2 min，15 000 r／min 離心10 min，吸取上清液50 μL。

質控液：稱取萬古霉素對照品11.60 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，超純水溶解并定容至刻度，制成質量濃度為1.16 mg／mL 的萬古霉素貯備液，再經稀釋，得質量濃度分別為7.25 mg／L 和29.00 mg／L 的萬古霉素質控液Q2 和Q1。

1.2.3 血藥濃度監測

56 ℃水浴：患者給藥前30 min 同時抽取血樣，置2 個紅帽頭普通采血管內，分別于56 ℃水浴加熱樣本0 min 和30 min 后測定。

紫外照射：取質控液（Q2 和Q1）和血樣（血樣1 和血樣2），分別紫外照射0，30，60 min 后測定。

2 結果

2.1 水浴后血藥濃度

2份血樣56 ℃水浴加熱0 min 和30 min 后檢測，萬古霉素血藥濃度均無明顯變化。詳見表1。

2.2 紫外照射后血藥濃度

質控液和血樣紫外照射0，30，60 min 后檢測，萬古霉素降解，且隨照射時間的增長，降解率成倍增長。詳見表2。

表1 血樣56 ℃水浴加熱后萬古霉素血藥濃度監測結果（mg／L）

表2 紫外照射后質控液及血樣萬古霉素監測結果

2.3 紫外照射后萬古霉素HPLC 圖

結果見圖1。

3 討論

對于用于TDM 的樣本，應考慮在不影響檢測的前提下滅活病毒。可對COVID－19 患者血樣進行56 ℃水浴加熱30 min 處理，或于短波紫外條件下靜置30 min，以保證病毒滅活。

有研究表明，萬古霉素的穩定性不高，常溫放置即可觀察到顏色逐漸變紅，可能是其分子結構中存在酚基及二酚基，酚類的水溶液遇光易水合或氧化成醌而呈粉紅色[10]。萬古霉素監測血樣處理前4 ℃保存1 周，能保持相對穩定，處理后8 h 內能保持相對穩定，但處理后48 h 則開始出現降解[11]。

本研究結果顯示，經56 ℃水浴加熱30 min 處理后，不影響萬古霉素血藥濃度監測結果。因此，可采用濕熱法56 ℃水浴30 min 滅活病毒后，以HPLC 法監測COVID－19 患者的萬古霉素血藥濃度。

對于TDM 樣本，也可在短波紫外條件下靜置30 min，進一步保證病毒滅活。由于SARS－CoV－2 也可能通過氣溶膠傳播，故前處理操作盡可能在生物安全柜里完成，試驗前后采用紫外線消毒30 ～60 min[9]。前期試驗研究未提到萬古霉素質控液[12]、萬古霉素監測樣品（血樣、腦脊液和關節液）[13 －15]需遮光保存，更未考察紫外照射對萬古霉素血藥濃度監測的影響。但同時發現，萬古霉素質控液雖未遮光，但保存于4 ℃冰箱、6 個月內未有明顯降解。

本研究結果顯示，紫外照射極大地加快了萬古霉素的降解。可能是由于萬古霉素質控液存放于透明離心管內，而血樣存放多了采血管帽頭與標簽的遮擋，故降解率不同。但即使有遮擋，血樣暴露于紫外條件下，萬古霉素的降解仍對監測結果有較大影響，故采用HPLC 法監測COVID－19 患者萬古霉素血藥濃度時，不可用短波紫外滅活樣本病毒。同時，萬古霉素血樣、質控液在接受標本時（傳遞窗等地方）及生物安全柜內處理過程中常可能暴露于紫外線下，故應注意萬古霉素質控液與血樣均要避免紫外照射。

圖1 萬古霉素血藥濃度高效液相色譜圖

綜上所述，HPLC 法監測COVID－19 患者萬古霉素血藥濃度，可用濕熱法56 ℃水浴30 min 滅活樣本SARS－CoV－2，不可用紫外滅活方式，且萬古霉素質控液與血樣均要注意避免紫外照射。