miR-149和miR-196a2在亞洲人群中與腦卒中發(fā)病關(guān)系的Meta分析

楊錫彤，徐弘揚(yáng)，馬 蓉，王光明*

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心，云南大理 671000；2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

腦卒中（stroke）是一種突發(fā)性的腦血液循環(huán)障礙性疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高以及復(fù)發(fā)率高等特點，全球每年大約有1 500萬腦卒中的病人，其中死亡率高達(dá)20%，致殘率達(dá)50%〔1-2〕。腦卒中嚴(yán)重影響人們的生存質(zhì)量與生活水平，因腦卒中引發(fā)的一系列并發(fā)癥不僅給患者帶來痛苦，同時也增加了家庭和社會的負(fù)擔(dān)。腦卒中引起的死亡人數(shù)在我國死亡人數(shù)中占第二位，同時腦卒中也是導(dǎo)致多數(shù)成年人殘疾、生活不能自理的原因之一。腦卒中是一種復(fù)雜的多因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中包括不可改變的因素（遺傳因素）以及可改變的因素（環(huán)境因素），但是這些因素都不能解釋腦卒中的發(fā)病機(jī)制。而流行病學(xué)的研究認(rèn)為腦卒中的發(fā)生與遺傳因素有較大的關(guān)系〔3〕。

微小RNA（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNAs，在真核細(xì)胞中主要是由19～25個核苷酸組成，通過結(jié)合到目的基因信使RNA（mRNA）3’非編碼端，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而miRNAs參與了一系列重要的生命進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和新陳代謝等〔4-5〕。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是常見的遺傳變異之一，SNP存在于前體mir-RNA（pre-miRNAs）能影響成熟miRNAs的表達(dá)，通過目的基因改變多種生物功能。當(dāng)前的研究表明SNP的位點存在于4種前體mir-RNAs，包括miR-146a C＞G（rs2910164），miR-149 T＞C（rs2292832），miR-196a2 T＞C（rs11614913）和miR-499 A＞G（rs3746444），并且能與多種影響人類健康的疾病密切相關(guān)，例如腫瘤、高血壓、心血管疾病和糖尿病〔6-7〕。近來的研究發(fā)現(xiàn)miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C等位基因可能是遺傳的易感因素〔8-9〕。4種microRNAs會引起血管損傷反應(yīng)，在循環(huán)系統(tǒng)中與血栓形成或炎癥通路有關(guān)聯(lián)〔10〕。miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C基因多態(tài)性與腦卒中有相關(guān)性，但不同人群、不同地區(qū)存在差異性和不確定性，因此本研究擬通過對已發(fā)表的miR-149 T＞C和miR-196a2 T＞C基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性研究進(jìn)行Meta分析，以得出較為客觀的結(jié)論。

1 資料與方法

1.1資料來源與檢索策略電子檢索PubMed、Web of Science、CBM及中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，檢索時間從建庫到2018年11月，獲取有關(guān)microRNAs基因多態(tài)性和腦卒中的文章。為提高文獻(xiàn)的查全率和漏查率，分析過程中將進(jìn)一步對入選研究的參考文獻(xiàn)進(jìn)行擴(kuò)大檢索，輔以文獻(xiàn)追溯法查找相關(guān)文獻(xiàn)，以提高M(jìn)eta分析對文獻(xiàn)查全率的要求。英文檢索詞包括microRNAs、miR-149、miR-196a2、polymorphism、SNP、stroke、ischemic、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction，中文檢索詞包括miR-149、miR-196a2、微小RNA、基因多態(tài)性、腦卒中、腦缺血、腦血管疾病、腦出血、腦梗死、腦梗塞。以PubMed為例，具體檢索策略如下：

#1 miR-149 ORmiR-196a2

#2 polymorphism ORSNP

#3 stroke OR ischemic ORcerebrovascular

disease ORbrain hemorrhage ORintracranial

hemorrhage ORcerebral hemorrhage ORcerebral

infarction

#4 case-control ORcase control

#5#1 AND#2 AND#3 AND#4

1.2文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①研究對象：評估m(xù)iR-149、miR-196a2基因多態(tài)性和腦卒中發(fā)病的相關(guān)性；②研究設(shè)計：文章為病例對照研究；③干預(yù)措施：病例組為腦卒中患者，對照組為健康人群；④足夠充分的數(shù)據(jù)可用于計算OR值；⑤對照組基因型分布符合HWE（Hardy-Weinberg Equilibrium）遺傳平衡定律。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①重復(fù)研究、發(fā)表的文獻(xiàn)；②對照組不符合HWE遺傳平衡；③數(shù)據(jù)描述不清或樣本資料交代不清，統(tǒng)計方法不恰當(dāng)；④腦卒中診斷不明確或沒有根據(jù)國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)；⑤綜述文獻(xiàn)；⑥非中、英文文獻(xiàn)。

1.3質(zhì)量評估對納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評價采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）評價，通過入選人群、組間可比性、暴露因素測量3個方面共8個條目對文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評價，滿分為9分，6分及以上認(rèn)為是高質(zhì)量文獻(xiàn)〔11-12〕，①病例確定是否恰當(dāng)（1分）；②病例的代表性（1分）；③對照組的選擇（1分）；④對照組的確定（1分）；⑤實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時考慮病例組和對照組的可比性（2分）；⑥暴露因素的確定（1分）；⑦病例組和對照組暴露因素的確定方法相同（1分）；⑧無應(yīng)答率（1分）。

1.4數(shù)據(jù)提取參考Cochrane協(xié)作網(wǎng)推薦的方法編制資料提取表，由兩名研究者獨立篩選文獻(xiàn)、提取資料并進(jìn)行交叉核對，如有不一致觀點通過討論進(jìn)行解決。提取資料的主要內(nèi)容為：①文獻(xiàn)的基本特征（包括文題、年份、研究者姓名等）；②所納入文獻(xiàn)研究對象的基本特征、干預(yù)措施和結(jié)局指標(biāo)。研究特征：研究地區(qū)和人群特征、研究組和對照組的例數(shù)和年齡特征；數(shù)據(jù)提取：研究組和對照組的各基因型的分布情況。

1.5統(tǒng)計分析采用Stata12.0進(jìn)行Meta分析，本Meta分析對于計數(shù)資料的效應(yīng)指標(biāo)選取比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。異質(zhì)性檢驗的檢驗方法采用Q檢驗和I2統(tǒng)計量，如果異質(zhì)性檢驗結(jié)果P≥0.05、I2＜50%，表示各研究間沒有異質(zhì)性，選用固定效應(yīng)模型，計算合并比值并繪制森林圖；如果異質(zhì)性檢驗結(jié)果P＜0.05、I2＞50%，表示研究間存在異質(zhì)性，選用隨機(jī)效應(yīng)模型。計算合并的OR和95%CI，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1納入的文獻(xiàn)基本特征初步檢索出文獻(xiàn)65篇，其中PubMed 13篇，Web of Science 8篇，CBM 11篇，中國知網(wǎng)29篇，萬方3篇，維普1篇。按照文獻(xiàn)納入排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終剩余8篇文獻(xiàn)。見圖1。文獻(xiàn)對照組都符合HWE檢驗，共計6 472例研究對象，其中病例3 332例，對照3 140例，納入研究的基本特征及對照組的HWE檢測見表1～2。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 Meta分析的結(jié)果

2.2.1 miR-149 rs2292832 對5種遺傳學(xué)模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明攜帶C或CC基因的人群與腦卒中的發(fā)生風(fēng)險差異有統(tǒng)計學(xué)意義，miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中有相關(guān)性，人群中攜帶C或CC基因明顯增加了腦卒中的發(fā)生風(fēng)險。結(jié)果見表3，森林圖見圖2。

2.2.2 miR-196a2 rs11614913 對5種遺傳學(xué)模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明攜帶C或CC基因的人群與腦卒中的發(fā)生風(fēng)險差異無統(tǒng)計學(xué)意義，miR-196a2 rs11614913多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性。結(jié)果見表4，森林圖見圖3。

表1 納入研究miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基本特征

表2 Meta分析中miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基因型分布

表3 miR-149 rs2292832遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果

圖2 miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中發(fā)生風(fēng)險森林圖

表4 miR-196a2 rs11614913遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果

圖3 miR-196a2 rs11614913基因多態(tài)性與腦卒中發(fā)生風(fēng)險森林圖

2.3發(fā)表偏倚和敏感性分析分別對納入文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析繪制漏斗圖，見圖4～5，漏斗圖基本對稱可能會存在發(fā)表偏倚，但發(fā)表偏倚較小不影響最終結(jié)果。對納入文獻(xiàn)逐一剔除進(jìn)行敏感性分析，并與排除前的合并效應(yīng)量進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)效應(yīng)量無明顯改變，表明此次研究結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖4 miR-149 rs2292832 5種遺傳學(xué)模型漏斗圖

圖5 miR-196a2 rs11614913 5種遺傳學(xué)模型漏斗圖

3 討論

近年導(dǎo)致腦卒中的疾病呈現(xiàn)多樣性，其中高血壓、糖尿病是熟知的引起腦卒中的最常見疾病。在探討腦卒中的發(fā)病機(jī)制的臨床研究中，遺傳因素與腦卒中的關(guān)聯(lián)性研究是目前的研究熱點。動脈粥樣硬化、血脂異常、高血壓以及高同型半胱氨酸血癥等為腦卒中的傳統(tǒng)危險因素。近年流行病學(xué)的研究表明遺傳因素中的基因突變增加腦卒中發(fā)生風(fēng)險性的比例逐漸加重〔21〕。近年的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs作為小分子RNAs，參與了腫瘤、免疫的功能系統(tǒng)、細(xì)胞增殖、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病的病理和生理進(jìn)程，此外miRNAs還能夠調(diào)節(jié)30%的人類基因表達(dá)〔22〕。近年來有關(guān)miR-149和miR-196a2基因多態(tài)性與腦卒中易感性的研究結(jié)果不一致，并且同一種族不同人群、不同地區(qū)存在不確定性。為此，本研究就miR-149和miR-196a2基因多態(tài)性與亞洲人群腦卒中易感性進(jìn)行Meta分析，旨在揭示兩種miRNAs基因多態(tài)性與腦卒中易感性之間的相關(guān)性，為遺傳學(xué)上對腦卒中危險因素的分子診治具有重要意義。

當(dāng)前對miRNAs與腦卒中相關(guān)性的研究較多，但研究結(jié)果不盡相同。本研究通過Meta分析表明miR-149、miR-196a2中僅有miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生有相關(guān)性，人群中攜帶C和CC基因型患腦卒中的風(fēng)險性明顯增加，而miR-196a2 rs11614913基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性。Xiao等〔23〕的Meta分析中，只納入了兩個研究結(jié)果，該研究表明miR-149 rs2292832基因多態(tài)性能降低腦卒中發(fā)生風(fēng)險。由于不同的研究者納入研究的樣本量的不同而影響了結(jié)果的一致性。本研究共納入了8個研究，通過增加樣本量得到了與Xiao等〔23〕的研究不一致的結(jié)論，miR-149 rs2292832基因多態(tài)性能增加腦卒中的發(fā)生風(fēng)險。本研究比Xiao等〔23〕的研究結(jié)果可信度更高。Xiao等〔23〕的納入研究樣本量過少可能是導(dǎo)致與本研究結(jié)果不一致的主要原因。miR-149和miR-196a2的等位基因與腫瘤壞死因子α（TNF-α）、亞甲基四氫葉酸、C反應(yīng)蛋白（CRP）有密切聯(lián)系，并且miR-149能與亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶基因的mRNA-3’UTR結(jié)合從而調(diào)控此基因的表達(dá)〔24〕。而亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶在編碼甲硫酸-葉酸代謝中起到重要作用，其在人體內(nèi)具有活性的5-甲基四氫葉酸（5-MTHFR）的 形 成 過 程 中 起 到 促 進(jìn) 作 用〔25〕。miR-149 rs2292832位點位于miR-149前體序列非成熟結(jié)合區(qū)內(nèi)，miR-149-5p的表達(dá)受rs2292832位點的影響，其中攜帶CC人群體內(nèi)miR-149-5p的表達(dá)量明顯高于攜帶CT和TT人群的表達(dá)量〔26〕。攜帶有miR-149 rs2292832位點基因型CC者體內(nèi)葉酸水平明顯低于基因型TT攜帶者〔22〕。有研究表明人體內(nèi)低表達(dá)亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶可明顯增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險，并且腦卒中患者體內(nèi)的葉酸水平與健康人群相比明顯降低，而體內(nèi)葉酸水平較低者通過補(bǔ)充葉酸后腦卒中的發(fā)生風(fēng)險明顯降低〔8，10〕。因此可認(rèn)為miR-149 rs2292832位點C等位基因和CC基因型通過影響成熟miR-149，調(diào)控miR-149與亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶基因結(jié)合，降低亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)，抑制甲硫酸-葉酸代謝，降低體內(nèi)5-MTHFR的生成，從而促進(jìn)腦卒中的發(fā)生。體內(nèi)低5-MTHFR表達(dá)可增加血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平，而高Hcy血癥是誘發(fā)心腦血管疾病的中度危險因素，它可以造成血管內(nèi)皮損傷和功能異常，刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，破壞機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)，影響脂質(zhì)代謝等，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)，從而增加了心腦血管疾病發(fā)病的危險性〔27〕，通過降低5-MTHFR的生成從而導(dǎo)致血漿Hcy水平增高，促進(jìn)腦卒中的發(fā)生。

本研究納入文獻(xiàn)僅限于中英文符合要求的文獻(xiàn)，研究人群均為亞洲人群，具有較好的地區(qū)代表性。該研究對揭示亞洲人群miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913基因多態(tài)性與腦卒中易感性之間的相關(guān)性較為合理、可靠。本研究存在不足是樣本量較為局限，今后希望能通過大樣本、多中心、同質(zhì)性的病例對照研究，對不同地區(qū)的人群進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)聯(lián)性。