基于Label-free技術(shù)分析補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的肝毒性作用機(jī)制

朱 月，王 姍，徐麗嬌，孫曉波，季宇彬，孫桂波*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193）

藥物性肝損傷（DILI）是指在疾病治療過程中，由于藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝細(xì)胞毒性損害或肝臟對(duì)藥物及代謝產(chǎn)物過敏所致的疾病。DILI可在無肝臟疾病的人群中發(fā)生，在已有基礎(chǔ)肝臟疾病的患者中更易發(fā)生〔1〕。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（Bavachinin，BVC）是補(bǔ)骨脂乙醇提取物中的一種黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、治療哮喘及心血管疾病等作用，在藥物開發(fā)與臨床應(yīng)用中價(jià)值較大〔2〕。現(xiàn)有研究表明BVC具有明顯的肝細(xì)胞毒性〔3〕，但該化合物的肝毒性靶點(diǎn)尚不明確，不利于其開發(fā)研究，因此明確其肝毒性靶點(diǎn)至關(guān)重要。

非定量法（Label-free）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種非標(biāo)記的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，該技術(shù)不使用同位素標(biāo)記物，而是直接根據(jù)質(zhì)譜峰的強(qiáng)度來對(duì)肽段或蛋白進(jìn)行相對(duì)定量〔4〕。首先，將提取所得到的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生肽段，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對(duì)肽段進(jìn)行分離，然后使用特定軟件檢索原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，解析出不同樣本中各個(gè)肽段的定量信息，進(jìn)而獲得在不同樣本中蛋白質(zhì)的定性和定量信息。該技術(shù)的優(yōu)勢有樣本操作量少，檢測到的低豐度蛋白較多，這些優(yōu)勢使Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)快速成為近年來重要的質(zhì)譜定量方法。本研究利用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，Proteome Discover軟件結(jié)合uniprot-homo+sapiens20180702_173026.fasta數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)組分差異，篩選在BVC作用前后蛋白質(zhì)組分的變化趨勢，為探索BVC引起肝毒性的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)一步研究BVC肝毒性機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1細(xì)胞HepaRG細(xì)胞購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2藥物與試劑補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（批號(hào)：161205），純度99.93%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；碳酸氫銨（Sigma，批號(hào)：09830-500G）；尿酸（Sigma，批號(hào)：U5378）；Tris（Amresco，批號(hào)：0497）；碘代乙酰胺（Vetec，批號(hào)：V900335-5g）；二硫蘇糖醇（Genview，批號(hào)：CD116-25g）；胰蛋白酶（Promega，批號(hào)：V5113）；甲酸（Sigma，批號(hào)：94318）；氨水（Sigma，批號(hào)：318612）；乙腈（Sigma，批號(hào)：34851）；胎牛血清（Gibco，批號(hào)：42Q1627K）。

1.3儀器超凈工作臺(tái)（上海智成分析儀器制造有限公司，ZHJH-C1115B）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific，Heraeus BB15）；倒置熒光顯微鏡（美國Life Technologies，EVOSFL Ima-ging）；高速離心機(jī)（Thermo Scientific，Pico 17 Centrifuge）；熱干濃縮儀（Thermo Scientific，SC210A）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器，SQP）。

2 方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng)與蛋白質(zhì)的提取取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用新鮮的完全RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整到2×105個(gè)/mL后，接種到HepaRG細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5 mL（含細(xì)胞1×106個(gè)），在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，藥物組加入終濃度為6.25μmol/L的BVC作用24 h，對(duì)照組加等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基作用24 h。

24 h后，收集上清液于離心管中，1 500 r/min離心5 min。每個(gè)培養(yǎng)瓶加入1 mL胰蛋白酶，37℃消化5 min，待細(xì)胞完全消化后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，慢慢吹打細(xì)胞至細(xì)胞全部脫離瓶壁，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，-20℃存放。采用北京邦菲生物科技有限公司哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取蛋白。

2.2蛋白酶解首先進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，然后取60μg定量好的蛋白溶液于離心管中。加入5μL 1 mol/L二硫蘇糖醇溶液混勻，37℃孵育1 h；加入20μL 1 mol/L碘代乙酰胺溶液，混勻后，室溫避光孵育1 h；轉(zhuǎn)移樣品至超濾管中，離心后棄去上清；加入100μL尿酸至超濾管中，離心后棄去上清，重復(fù)2次；加入50 mmol/L碳酸氫鈉100μL，離心后棄去上清，重復(fù)3次；更換新收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50：1的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解12～16 h。

2.3質(zhì)譜分析

2.3.1 毛細(xì)管高效液相色譜 每份樣品采用高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣到質(zhì)譜柱，再經(jīng)分析柱分離，流速及相關(guān)液相梯度見表1。

表1 液相色譜洗脫梯度參數(shù)

2.3.2 質(zhì)譜鑒定 每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2.4數(shù)據(jù)分析采用Proteome Discoverer 2.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，肽鑒定使用SEQUST搜索引擎與人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。參數(shù)設(shè)定：肽質(zhì)量耐受：±15 ppm；MS/MS耐受性：0；酶解方式：胰蛋白酶；固定修飾：氨基甲基；可變修飾：氧化。

2.5生物信息學(xué)分析采用PANTNER對(duì)鑒定出的差異蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析，對(duì)表達(dá)差異蛋白進(jìn)行蛋白功能富集與分析。通過KEGG通路數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白所在的信號(hào)通路進(jìn)行分析與篩選。

3 結(jié)果

3.1蛋白濃度測定通過測定樣品吸光度，利用考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白濃度。見表2。

表2 樣品蛋白濃度

3.2 HepaRG細(xì)胞加入BVC前后差異表達(dá)蛋白經(jīng)鑒定共有差異蛋白372個(gè)，其中上升趨勢蛋白有170個(gè)，下降趨勢蛋白有202個(gè)。見圖1。采用兩組樣本間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異倍數(shù)（FC）和t檢驗(yàn)得到的P值兩個(gè)因素共同繪制火山圖，用于顯示兩組樣本數(shù)據(jù)的顯著性差異。

圖1 差異蛋白火山圖

3.3差異蛋白生物過程分析經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索共得出差異蛋白372個(gè)，蛋白生物過程表明蛋白質(zhì)組分富集于RNA的加工和修飾、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體劃分、細(xì)胞防御機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等生物過程。見圖2。

3.4差異表達(dá)蛋白GO分析對(duì)鑒定出的372個(gè)差異蛋白進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明：參與生物過程的蛋白分別涉及代謝過程、細(xì)胞過程等，參與細(xì)胞組成的差異表達(dá)蛋白分別位于細(xì)胞連接部、細(xì)胞外區(qū)部、膜部等，參與分子功能的蛋白分別涉及結(jié)合物受體活性、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、分子換能器活性、結(jié)構(gòu)分子活性等。見圖3。

3.5差異表達(dá)蛋白信號(hào)通路鑒定與分類KEGG通路分析表明，差異蛋白共涉及30條信號(hào)通路。其中代謝途徑與氨基酸降解途徑所涉及的差異蛋白較多。見圖4。

圖2 差異蛋白生物過程分析

圖3 差異表達(dá)蛋白GO分析

圖4 KEGG通路

4 討論

肝臟在異體生物化合物的轉(zhuǎn)化和代謝中具有重要作用，異體生物化合物的轉(zhuǎn)化和代謝反過來又可導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)各種并發(fā)癥〔5〕。藥物引起的肝毒性是近年來的研究熱點(diǎn)之一，在新藥的研發(fā)中肝毒性的研究也十分重要。所以明確藥物導(dǎo)致肝損傷的作用機(jī)制十分重要。

本研究應(yīng)用Label-free高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，比較在HepaRG細(xì)胞經(jīng)BVC處理前后蛋白質(zhì)組分的差異變化。結(jié)果表明，獲得的差異蛋白共有372個(gè)，其中上升趨勢蛋白170個(gè)（P≤0.05，F(xiàn)C≥1.500），下降趨勢蛋白202個(gè)（P≤0.05，F(xiàn)C≤0.667）。然后，在上升和下降趨勢表達(dá)蛋白中篩選出變化較大的前十名蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明，這20種蛋白所作用的生物過程各不相同。在上升趨勢蛋白中，GPC1的FC值最高，變化趨勢最明顯。GPC1蛋白能夠與銅離子、成纖維細(xì)胞生長因子、肝素硫酸多糖以及層粘連蛋白結(jié)合。且研究發(fā)現(xiàn)GPC1基因可通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt/β-Catenin通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲式增殖〔6〕。同時(shí)GPC1基因也是直腸癌、胰腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)〔7-8〕。因此，我們推測BVC可能誘導(dǎo)GPC1基因的高表達(dá)影響細(xì)胞中AKT、AMPK、EGFR等通路，從而影響細(xì)胞的遷移與生長而導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性。下降趨勢蛋白中UPF2的變化趨勢較明顯，UPF2蛋白與細(xì)胞核mRNA的輸出有關(guān)〔9〕。mRNA又稱信使RNA，是攜帶遺傳信息在蛋白質(zhì)合成時(shí)充當(dāng)模板的RNA〔10〕。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與〔11〕。而UPF2蛋白的表達(dá)下降可導(dǎo)致mRNA的輸出降低從而影響蛋白質(zhì)的合成。蛋白質(zhì)的合成降低，細(xì)胞無法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)從而導(dǎo)致肝損傷。所以我們推測BVC引起UPF2蛋白的表達(dá)下降，導(dǎo)致mRNA的輸出降低，蛋白質(zhì)合成減少，從而導(dǎo)致肝損傷。

在差異蛋白的生物過程分析中，我們發(fā)現(xiàn)其中有10種蛋白與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生有關(guān)（Q09028、Q9Y2P8、Q08257、Q8NBN7、Q15293等），6種蛋白與RNA的加工和修飾有關(guān)，13種蛋白與翻譯有關(guān)（Q8WUD1、Q02127、O95363、P53597、Q96SI9等），10種蛋白與翻譯后的修飾和蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)有關(guān)（Q9BTZ2、Q5TDH0、Q96GQ7、Q8TDD1、O14578等），11種蛋白與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)（P33908、Q9Y383、P11047、Q8WVC0、Q9NZL4等）。表明BVC可能通過調(diào)節(jié)RNA的加工和修飾、蛋白質(zhì)的翻譯與轉(zhuǎn)錄，以及翻譯后的修飾和蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)從而影響脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝。脂質(zhì)在體內(nèi)承擔(dān)的主要責(zé)任是氧化供能，機(jī)體的能量倉庫是脂肪組織，脂肪也能協(xié)同皮膚、骨骼、肌肉保護(hù)內(nèi)臟，防止體溫散發(fā)和幫助食物中脂溶性維生素的吸收。脂質(zhì)代謝紊亂是指由于先天或后天因素造成的血液及其他組織器官中脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物質(zhì)和量的異常〔12〕。所以我們推測BVC可能通過降低脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝能力，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂而產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性。

在進(jìn)行了差異蛋白的GO分析后，本研究又進(jìn)行了KEGG通路分析，分析發(fā)現(xiàn)位于代謝通路的差異蛋白最多，其中上升趨勢蛋白有17個(gè)，下降趨勢蛋白有41個(gè)。代謝途徑是指在生物體內(nèi)由酶催化的一連串在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，形成使用或儲(chǔ)存的代謝物，從而保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。代謝途徑是維持細(xì)胞穩(wěn)定良好生長非常重要的一條通路，代謝紊亂可引起身體的各種疾病，例如糖尿病由糖代謝紊亂引起，高脂血癥由脂代謝紊亂引起，痛風(fēng)由尿酸代謝紊亂引起等等。所以維持代謝的穩(wěn)定十分重要〔13〕。而我們的研究結(jié)果表明BVC可引起代謝通路中大量基因的改變，所以我們推測BVC所誘導(dǎo)的肝損傷是由于代謝通路中基因的改變從而導(dǎo)致代謝紊亂而引起的。

BVC藥理作用廣泛，開發(fā)研究的價(jià)值較大，所以明確其肝毒性機(jī)制更利于其開發(fā)研究。本實(shí)驗(yàn)利用Label-free高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)與KEGG信號(hào)通路分析技術(shù)研究推測BVC可能通過影響代謝通路中的某些基因而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂從而引起肝毒性。但BVC具體作用于哪些基因與通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。