燈誘草地貪夜蛾的識別鑒定及交配狀態分析

龔建福 武晴雯 王攀

摘要 [目的]明確誘蟲燈能否有效地監測與防治草地貪夜蛾以及燈誘草地貪夜蛾的交配狀態。[方法]從玉米田中燈誘得到疑似草地貪夜蛾成蟲，對其進行生殖系統解剖與分子鑒定，明確其生物型、性別、交配及產卵狀態。[結果]誘蟲燈共誘捕到43頭疑似草地貪夜蛾，經分子鑒定，確定其中40頭是草地貪夜蛾;燈誘草地貪夜蛾中，雌蟲全部已交配，占總數的62.5%，其中已產卵雌蟲占總雌蟲的88%，單燈平均每晚誘捕已產卵雌蟲5.3頭，交配未產卵雌蟲為1頭。[結論]草地貪夜蛾具有趨光性，可使用燈光誘控技術對草地貪夜蛾進行監測或防控;燈誘草地貪夜蛾雌蟲中，大部分都已交配產卵。

關鍵詞 草地貪夜蛾;燈光誘控;形態識別;分子鑒定;交配狀態

Abstract [Objective]To clarify whether the light trap can effectively monitor and control Spodoptera frugiperda and analyze the mating state of the moth captured by light trap.[Method]The suspected adult of S.frugiperda were captured by light trap in the corn field，and analysis of anatomy of reproductive system and molecule information of the suspected moth were followed then，so that determining biotype identity，sex，mating and spawning status.[Result]The trap light captured a total of 43 suspected S.frugiperda，after molecular identification，it was determined that 40 of them were S.frugiperda.Among the S.frugiperda captured by light trap，the females all had mated，accounting for 62.5% of the total，and most of them had laid eggs，accounting for 88% of the total females，and there were 5.3 produced females and only 1 unfertilized females was trapped per night averagely.[Conclusion]This study states that the moth has phototropism and it can be monitored or controlled by light trap and most of the females had laid eggs.

Key words Spodoptera frugiperda;Light trap;Morphological identification;Molecular identification;Mating status

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （Smith）也稱秋黏蟲，屬鱗翅目夜蛾科，廣泛分布于美洲大陸，是一種為害嚴重的雜食性農業害蟲，有“玉米型”和“水稻型”2個生物型[1]。近年來，草地貪夜蛾的擴散范圍與速率逐漸增大，2018年5月草地貪夜蛾入侵南亞的印度，隨后向周邊國家蔓延[2-3]，2019年1月11日在我國云南省普洱市首次發現草地貪夜蛾[4]。草地貪夜蛾具有繁殖力高、遷飛能力強及暴發為害等特點，對我國的糧食作物安全生產造成嚴重威脅。

草地貪夜蛾入侵我國后，國內專家在其遷飛擴散、鑒定識別、監測防控等方面迅速開展了大量工作[5-7]。研究表明，可應用黑光燈及性引誘劑來監測草地貪夜蛾成蟲發生動態[8];提出了可以通過種植抗性或耐受性的玉米品種，利用天敵以及使用生物農藥，使用誘蟲燈誘殺等防控草地貪夜蛾[9]。燈光誘控技術具有使用方便、效果明顯、易于大規模推廣應用等特點，被廣泛用于很多農林害蟲的防治和種群監測[10]。截至目前，國內外對利用燈光誘控來防治與監測草地貪夜蛾的研究不足，國內雖提出使用誘蟲燈防控草地貪夜蛾，但燈光誘控草地貪夜蛾如何識別，燈光誘控技術能否應用于草地貪夜蛾的監測與防控，尚需進一步明確。

筆者利用試制的誘蟲燈田間誘捕得到草地貪夜蛾成蟲，室內基于COⅠ和Tpi? 2個基因片段對其進一步分子鑒定和解剖觀察其交配狀態，為明確燈光誘控在草地貪夜蛾監測與防治中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和方法 試驗在湖北省武漢市農科院蔬菜研究所的甜玉米地（114.47°E、30.71°N）進行，面積約3 000 m2，玉米苗株高40 cm左右。2019年9月3日調查發現，玉米田中有草地貪夜蛾卵塊，設置試制誘蟲燈（功率為15 W）誘集草地貪夜蛾成蟲，誘蟲燈集蟲口與地面距離約1 m，燈周圍100 m內無高大建筑遮擋與大功率照明光源。2019年9月5—9日連續開燈進行草地貪夜蛾誘捕試驗，試驗期間天氣晴朗無風，開燈時間為19：00至次日07：00。

1.2 草地貪夜蛾形態學鑒定 通常，燈誘鱗翅目昆蟲鱗粉多已掉落，難以通過前翅準確鑒定。依據趙勝園等[11]和郭井菲等[12]報道的草地貪夜蛾形態特征，觀察誘集成蟲的個體大小、后翅顏色與頂角處灰色斑紋及延伸位置（圖1），對燈誘草地貪夜蛾進行鑒定。

1.3 性別及雌蟲交配產卵狀態 對燈誘疑似草地貪夜蛾進行解剖，根據生殖系統差異判別雌雄后，參考趙勝園等[13]的研究方法，通過雌蛾交配囊狀態判定其交配產卵情況。然后，將單頭樣品迅速裝入2 mL離心管，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于種類及生物型的分子鑒定。

1.4 種類及生物型鑒定 研究表明，基于線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome coxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因序列分析可以準確鑒定草地貪夜蛾，以及位于Z染色體上的磷酸甘油醛異構酶基因（triosephosphate isomerase，Tpi）可以鑒定其生物型[14-15]，故利用COⅠ基因和Tpi基因對草地貪夜蛾進行分子鑒定。樣品DNA的提取使用DNA試劑盒Animal Tissue DNA Kit（Simgen，中國），按照說明書進行操作。將得到的DNA產物作為PCR擴增的模板，參考張磊等[6]的方法分別對COⅠ基因和Tpi基因進行擴增，引物序列：CoⅠ-F 5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACTC-3′，CoⅠ-R 5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′;Tpi-F 5′-GGTGAAATCTCCCCTGCTATG-3′，Tpi-R 5′-AATTTTATTACCTGCTGTGG-3′[16]。將PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后送擎科創新生物科技有限公司測序。

1.5 數據分析 在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中下載草地貪夜蛾與近緣物種COⅠ基因序列，利用MEGA 7.0進行序列比對與構建系統發育進化樹鑒定是否為草地貪夜蛾，比較Tpi基因序列的特異性堿基位點的差異，明確草地貪夜蛾“玉米型”和“水稻型”[17]。采用SPSS 21.0 軟件對每晚誘蟲燈捕獲的草地貪夜蛾雌、雄及已產卵與交配未產卵雌蛾數量進行Student′s t test測驗（*P<0.05，**P<0.01）。

2 結果 與分析

2.1 燈誘草地貪夜蛾的物種分子鑒定

燈誘共獲得43頭疑似草地貪夜蛾成蟲，依次編號為Wuhan1～Wuhan 43，并基于COⅠ基因和Tpi基因進行分子鑒定。PCR擴增結果顯示，COⅠ基因長度約800 bp，Tpi基因長度約400 bp，均與預期片段大小一致（圖2）。通過測序得到所有樣品COⅠ基因片段和Tpi基因片段的準確序列，利用序列比對和從NCBI數據庫中搜集到草地貪夜蛾近緣物種及鱗翅目其他昆蟲的COⅠ序列構建系統發育進化樹（圖3），發現Wuhan12、Wuhan15、Wuhan24與其余樣品的COⅠ基因、Tpi基因序列相似度低，BLAST結果顯示其與斜紋夜蛾親緣最近，系統發育進化樹結果顯示Wuhan12、Wuhan15、Wuhan24與斜紋夜蛾聚為一支，鑒定為斜紋夜蛾，而非草地貪夜蛾。其余40個樣品的COⅠ基因和Tpi基因的序列與草地貪夜蛾的相似度高達99%，確定為同一物種，選取樣品Wuhan1作為代表進行系統發育進化樹分析，樣品Wuhan1與草地貪夜蛾聚為一支（圖3），表明燈誘所得40個樣品均為草地貪夜蛾。

2.2 燈誘草地貪夜蛾的生物型鑒定 分別將已確定40個草地貪夜蛾樣品的Tpi基因序列與已發表2種生物型的Tpi基因序列進行比對分析，結果顯示，在能夠區分“水稻型”和“玉米型”的10個堿基位點中，確定為草地貪夜蛾的40個樣品與“玉米型”完全一致（圖4），表明燈誘的草地貪夜蛾樣品均為“玉米型”。

2.3 燈誘草地貪夜蛾的性別及交配產卵狀態 對分子鑒定確定的40頭燈誘草地貪夜蛾分析表明，雄蟲占37.5%，雌蟲占62.5%，雌蟲全部已交配，其中大部分已產卵，占總雌蟲的88%。單燈每晚平均誘捕草地貪夜蛾10頭，其中，雌蟲6.2頭，雄蟲3.8頭，二者無顯著差異（t=1.109，P=0.348）;單燈每晚平均誘捕已產卵雌蟲5.3頭，交配未產卵雌蟲1頭，二者差異顯著（t=4.490，P=0.021）（圖5）。

3 討論

利用誘蟲燈控制農林害蟲高效、環保，極大地減少了農業生產中化學農藥的施用。草地貪夜蛾成蟲具有較強遠距離飛行能力，成蟲在產卵前可遷飛500 km[18]。國外利用誘蟲燈研究草地貪夜蛾擴散能力的試驗表明，誘蟲燈對草地貪夜蛾成蟲的誘捕率與釋放距離有關，但總體誘捕效果不佳[19]。與國外研究結果較為類似，該研究表明誘蟲燈可誘捕到草地貪夜蛾成蟲，但誘捕效率低，每晚單燈誘捕成蟲僅10頭左右;昆蟲的趨光行為受性別、交配行為及發育階段等因素的影響[20]，該研究誘捕到的草地貪夜蛾雌蛾大部分已交配，推測草地貪夜蛾的趨光行為與其交配、產卵等生殖行為有關。因此，燈光誘控技術對草地貪夜蛾的監測與防控的效果還需進一步探討。

草地貪夜蛾與斜紋夜蛾的形態與個體大小十分相似[11]，加之燈誘鱗翅目成蟲鱗粉大部分已掉落，識別較為困難。該研究在基于后翅形態鑒別出草地貪夜蛾的基礎上[11-12]，再利用COⅠ基因序列鑒定，發現形態鑒定準確率達93%，說明草地貪夜蛾后翅特征可用于野外燈光誘捕監測或防控中草地貪夜蛾的識別，必要時可再輔助分子鑒定。國內報道，入侵我國的草地貪夜蛾為“玉米型”[6]，該研究燈誘草地貪夜蛾分子鑒定進一步說明入侵到我國的草地貪夜蛾為“玉米型”，“水稻型”是否入侵我國，有待進一步監測。

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