一株半滑舌鰨致病性假交替單胞菌的分離鑒定與藥敏特性分析

鮑玉杰 尚玉曼 王恒

摘要 從患皮膚潰瘍病的半滑舌鰨肝臟中分離到一株優勢菌株CSLG2，根據細菌形態學觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列鑒定及系統發育進化樹分析結果，發現該菌株與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）同源性最高。對該菌株進行藥敏試驗，結果發現該菌對米諾環素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等藥物高度敏感，而對紅霉素、四環素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素和呋喃妥因具有一定的耐藥性。

關鍵詞 半滑舌鰨;假交替單胞菌;16S rDNA;藥敏特性

Abstract A dominant strain CSLG2 was isolated from the liver of Cynoglossus semilaevis Günther with skin ulcer disease.According to the results of bacterial morphology observation，physiological and biochemical identification，16S rDNA sequence identification and phylogenetic tree analysis，the results showed that this strain had the highest homology with Pseudoalteromonas.The drug sensitivity test results of this strain showed that the bacteria was highly sensitive to minocycline，erythromycin，ceftazidime，ceftriaxone，chloramphenicol，norfloxacin，ofloxacin，and ciprofloxacin.However，it had certain resistance to erythromycin，tetracycline，cefazolin，ceftriaxone，penicillin and nitrofurantoin.

Key words Cynoglossus semilaevis Günther;Pseudoalteromonas;16S rDNA;Drug sensitivity

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther） 是一種溫水性近海大型底層魚類，隸屬鰈形目（Pleuronectiforme）舌鰨科（Cnoglossidae）舌鰨屬（Cynoglosus），由于其活動范圍小、營養等級低、個體大、生長快，目前已成為我國沿海地區海水養殖魚類的優良品種之一[1-2]。但是，隨著產業規模的不斷擴大，近年來養殖半滑舌鰨陸續發生各種疾病，臨床常見體表潰瘍病、爛尾病、腹水癥等[3-5]。目前鰨類疾病主要有細菌性疾病、寄生蟲性疾病、病毒性疾病3種類型，其中報道最多的是細菌性疾病，其主要病原有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、河口弧菌（V.aestuarianu）、鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）、海水屈撓桿菌（Tenacibaculum maritimum）、鰨屈撓桿菌（T.soleae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）等[6]。為進一步研究養殖半滑舌鰨潰瘍病的病原及其發病機制，筆者對患病半滑舌鰨進行了病原菌篩取，主要從患病半滑舌鰨的體表、腎臟、脾臟、鰓、腸等部位分離出病原菌，經過形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析及系統發育學分析鑒定出一株假交替單胞菌，編號為CSLG2，并對其進行了藥敏試驗，旨在進一步探究其致病機制并為半滑舌鰨潰瘍病的防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株。菌株CSLG2分離自天津市某養殖場中養殖的患潰瘍病的半滑舌鰨肝臟。

1.1.2 試劑。2216E瓊脂、TSB培養基均購自北京陸橋技術股份有限公司;2×Taq PCR Master Mix酶、DNA Marker 購自博邁德生物有限公司;生化鑒定管、生物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器。超凈工作臺（SW-CJ-1FD，江蘇通凈凈化設備有限公司）;高壓滅菌鍋（SX-500，江陰濱江醫療有限公司）;離心機（Centrifuge 5415R Eppendorf）;PCR儀（BIO-BAO）;恒溫培養箱（SPX-105B-D，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;pH計（METTER TOLEDO，北京六一儀器廠）;數顯恒溫水浴鍋（HH-3A型，金壇市金南儀器制造有限公司）;電泳儀（DYY-6C型，北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化。在無菌條件下，用接種環蘸取患病半滑舌鰨的皮膚潰爛處、肝臟、脾臟、腎臟、腸道等，并在2216E瓊脂、TSB等固體培養基上劃線，置于28 ℃恒溫箱中培養24 h。挑取形態特征一致的優勢單菌落，再次接種到2216E固體培養基上進行分離純化，連續分離、純化3次后，挑取優勢單菌落置于滅菌的2216E液體培養基中，28 ℃恒溫培養24 h，將獲得的純化菌株加入20%的甘油保種，于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.2 形態結構觀察。首先在載玻片中央滴1滴水，用接種環挑取少量單菌落在載玻片上涂片固定，然后進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌形態。

1.2.3 生理生化鑒定。將純化得到的CSLG2菌株在2216E固體培養基上劃線，28 ℃培養24 h后，使用無菌牙簽挑取單菌落接種于細菌生化鑒定管中，并滴加1滴液體石蠟油，置于35 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察其顏色變化。參照《伯杰氏鑒定細菌學手冊》和《伯杰氏分類細菌學手冊》[7]，確定其生理生化特性。

1.2.4 16S rDNA檢測鑒定與系統發育分析。

1.2.4.1 16S rDNA的PCR擴增。從患病半滑舌鰨肝臟處分離到優勢菌株CSLG2，將純化得到的CSLG2菌株接種在2216E液體培養基中，28 ℃、220 r/min恒溫搖床中培養16 h后，取200 μL菌液在100 ℃沸水中煮10 min，然后1 200 r/min 離心10 min，上清即為DNA。以此DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系如下：模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 6.25 μL、無菌水4.25 μL。PCR反應條件如下：94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、72 ℃終延伸5 min。其中，PCR所用引物為細菌16S rDNA通用引物，正向引物為27 F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG），反向引物為1492 R（GGTTACCTTGTTACGACTT），引物由六合華大基因合成。

1.2.4.2 PCR產物的檢測及序列分析。取2 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余送交上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果通過NCBI網站的BLAST檢索系統進行同源系列比對分析，從中選取高度相似的序列，使用MEGA 6（molecular evolutionary genetic analysis，MEGA）軟件構建16S rDNA的系統發育進化樹。

1.2.5 藥物敏感性測定。采用K-B紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗[8]，取純化菌株CSLG2接種于2216E液體培養基中，于28 ℃恒溫培養箱中培養16 h后，進行梯度稀釋，采用平板計數方法配制1.0×108 CFU/mL的菌液，吸取100 μL涂布在2216 E固體培養基平板上。然后，用無菌鑷子將抗生素紙片輕輕貼在培養基表面，28 ℃恒溫培養24 h后，測定抑菌圈直徑，結果判定標準分為敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

患病的半滑舌鰨前期體表掉鱗，隨著病情的加重，體表肌肉潰爛，潰瘍面積不斷增大;腹部腫脹，嚴重的有脫肛現象，經解剖后腹腔中有大量腹水，嚴重時可致死（圖1）。

2.2 細菌形態學特征

菌株CSLG2在2216E瓊脂培養基平板上劃線得到單菌落，菌落呈圓形，表面光滑濕潤、有光澤，中央凸起，呈淡黃色，不透明，邊緣整齊（圖2）。革蘭氏染色結果顯示，菌株CSLG2為短桿狀，呈紅色，說明該菌株為革蘭氏陰性菌（圖3）。

2.3 生理生化特征

從細菌生化鑒定管的結果來看，CSLG2菌株對麥芽糖、N-乙酰葡糖胺的反應均呈陽性，并能利用葡萄糖，不能利用蔗糖，與側金盞花醇反應呈陰性，其余反應也均呈陰性（表1）。將生化管的鑒定結果結合《伯杰氏鑒定細菌學手冊》，其鑒定結果與假交替單胞菌最為相似。

2.4 16S rDNA序列分析及系統發育進化樹分析

以CSLG2菌株全DNA為模板，以通用引物27F 和 1492R 擴增得到CSLG2菌株16S rDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳得到一條1 500 bp 左右的條帶，條帶清晰且單一（圖4）。其余PCR產物經測序得到CSLG2菌株16S rDNA的序列大小為1 646 bp。將測序得到的拼接序列在NCBI網站上進行BLAST比對，發現菌株CSLG2與假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.IG23 ，序列號KU213138.1）同源性高達99%，由此可初步判定CSLG2菌株為假交替單胞菌屬。將CSLG2 16S rDNA序列與其同源性較高的序列進行系統發育進化樹分析，結果顯示其與Pseudoalteromonas sp.IMCC17052聚為一支，與Pseudoalteromonas sp.IG23同源性也較高（圖5），進一步說明菌株CSLG2菌株為假交替單胞菌。

2.5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果表明，CSLG2菌株對紅霉素、四環素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素、呋喃妥因均有耐藥性，對鏈霉素、磺胺異噁唑表現為中度敏感，而其他26種藥物均具有一定的抑菌效果，其中米諾環素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等具有較強的抑菌能力（表2）。

3 討論與結論

假交替單胞菌屬是 Gauthier 等[9]根據細菌16S rDNA 序列對交替單胞菌屬（Alteromonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、弧菌屬（Vibrio）以及假單胞菌屬（Pseudomonas）等若干菌株進行系統發育分析發現的區別于假單胞菌屬（ Pseudomonas） 和交替單胞菌屬（Alteromonas）的一個新屬。該菌廣泛分布于海洋環境中，是一類條件致病菌，能產生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物質等與致病相關的多種物質[10]。研究表明，假交替單胞菌可感染海水養殖藻類和養殖動物等，可引起藻類（如綠斑、黃斑[11-12]等）和養殖動物體表潰爛[13]等疾病。假交替單胞菌是引起海帶（Laminaria）孢子體紅點病[14]和孔爛癥[15]的病原菌，假交替單胞菌還可引起刺參（Apostichopus japonicus）腐皮病[16]、潰瘍病[17]等。Pujalte 等[18]從患病的海鱸體內分離到1株假交替單胞菌，并發現其在養殖環境惡化時引起金頭鯛和海鱸患病。喬遷等[19]從皮膚潰爛的七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）中分離出一株假交替單胞菌，并發現其可引起劍尾魚鱗片脫落、體表潰爛至死亡。白雪松等[10]從群體死亡日本對蝦（Penaeus japonicus）蚤狀幼體中分離到 1 株致病菌，經鑒定為假交替單胞菌，并通過回復感染證實其對蚤狀幼體和仔蝦具有致死性。

該研究從患病的半滑舌鰨肝臟處分離到一株優勢菌株CSLG2，根據菌落形態、細菌革蘭氏染色特征、生理生化鑒定、16S rDNA序列鑒定和系統發育學分析結果鑒定該菌株為假交替單胞菌。根據藥敏試驗結果，初步鑒定出CSLG2菌株對紅霉素、四環素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素、呋喃妥因有耐藥性，而米諾環素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等具有較強的抑菌能力，該研究結果有助于探討魚類疾病病原，并為防治該菌引起的半滑舌鰨及其他水生動物疾病提供參考。

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