基于超聲微波協(xié)同萃取法的仙人掌果皮黃酮提取工藝

于淑池,肖陳媛

(海南熱帶海洋學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 三亞 572022)

0 引言

仙人掌為雙子葉植物,在我國海南島及廣東雷州半島一帶大量生長,仙人掌果具有活化淤血、祛除濕氣、退熱清熱、生肌、消腫、強(qiáng)健胃脾、止痛凝血等多種功效[1].仙人掌果肉含有氨基酸、維生素、多糖類物質(zhì)、礦物元素等營養(yǎng)成分,特別是黃酮類物質(zhì)含量豐富[2-3].其果皮由于毛刺多,不便食用而長期未被開發(fā)利用,僅民間作水果食用[4].目前對仙人掌黃酮的提取多集中在可食用仙人掌[5]、仙人掌花[6]、仙人掌全果[7-9]等,仙人掌果皮黃酮的提取研究還未見報道.黃酮類物質(zhì)傳統(tǒng)提取方法主要有水提法、醇提法、堿提法和其他有機(jī)溶劑萃取法[10],超聲微波協(xié)同萃取法是一種工藝簡便、提取成本低、節(jié)約能源、提取率高的技術(shù)[11],本研究采用超聲微波協(xié)同萃取輔助乙醇提取技術(shù)提取仙人掌果皮中的黃酮,為仙人掌果皮的廢物利用,提升仙人掌果的經(jīng)濟(jì)價值,促進(jìn)仙人掌果的全面開發(fā)利用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料:仙人掌果,產(chǎn)地為海南三亞,購于三亞市勝利路旺豪超市;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(UV≧98%);溴化鉀光譜純;硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇(95%)均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LT-DBX23N型熱風(fēng)循環(huán)烘箱(立德泰勀上海儀器有限公司);RS-FS1401型電動食品加工機(jī)(合肥榮事達(dá)小家電有限公司);MultifugeX1R型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技中國有限公司);XO-SM200型超聲波微波化學(xué)反應(yīng)器(南京先歐儀器制造有限公司);T6型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher);FA2204B型電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司);SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-52型蒸發(fā)旋轉(zhuǎn)儀(上海亞榮生化儀器廠);Pilot7-12E型真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配置蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,稱取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,然后溶解于55%乙醇中,定容至50 mL,由此得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,其濃度為0.1 mg·mL-1.精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液:0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于6支比色管中,向不同濃度比色管中按順序加入0.6 mL 5%的NaNO2,搖晃均勻后靜置5 min,再加入0.6 mL 10%的Al(NO3)3,搖晃均勻后再靜置5 min,隨后加入8 mL 4%的NaOH,加入55%乙醇至比色管25 mL刻度處,搖勻靜置10 min后于510 nm波長處測定吸光度,試劑空白參比[12],從而得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程:y=0.523x-0.000 2,其中x代表蘆丁濃度(mg·mL-1),y為吸光度值,R2=0.991 5,擬合度高,線性關(guān)系較好.

1.3.2單因素及正交試驗(yàn)

仙人掌果皮烘干粉碎,過70目篩,采用超聲波微波協(xié)同萃取法,以黃酮提取量作為指標(biāo),分別稱取1.0 g仙人掌果皮各5份,初步固定微波功率300 W、超聲波功率480 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇濃度65%、提取時間40 min、提取溫度60 ℃,展開微波功率(0、100、200、300、400 W)、超聲波功率(240、360、480、600、720 W)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g·mL-1)、提取液乙醇濃度(45、55、65、75、85%)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)6個因素單因素試驗(yàn),在單因素試驗(yàn)此基礎(chǔ)上,選取對仙人掌果皮黃酮提取量影響較大的4個因子進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),因素水平見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.3 光譜掃描

1.3.3.1紫外-可見吸收光譜掃描:仙人掌果皮黃酮溶液在230～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,觀察并分析其特征吸收峰.

1.3.3.2傅里葉變換紅外光譜掃描:采用壓片法[13],稱取適量的仙人掌果皮黃酮樣品粉末和適量的溴化鉀粉末,其中樣品含量約為總含量的2%,混合后于瑪瑙研缽中紅外燈光的照射下進(jìn)行研磨,然后壓片,在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描.

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel和Origin7.5繪圖,顯著性差異采用Duncan多重比較檢驗(yàn)分析(P<0.05),黃酮提取量的計算,測定仙人掌果皮黃酮提取液吸光度值,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算仙人掌果皮提取液濃度,按如下公式

(1)

計算黃酮提取量(mg·g-1)，其中:X為仙人掌果皮黃酮濃度(mg· mL-1);M為稱取樣品質(zhì)量(g);V1為提取液體積(mL);V2為吸取樣液體積(mL);V3為定容體積(mL).

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.1.1 微波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

圖1 微波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定超聲波功率480 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇濃度65%、提取時間40 min、提取溫度60 ℃,測定不同微波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,按著公式(1)計算黃酮提取量,結(jié)果見圖1.

圖1顯示仙人掌果皮黃酮的提取量先升高后減少,微波功率達(dá)到200 W時,總黃酮提取量最高為10.41 mg·g-1,這種現(xiàn)象可能由于提取初期微波功率為零,只有超聲波作用,然后隨著微波功率開始增大,果皮細(xì)胞會被微波輻射損壞,這促進(jìn)了黃酮類化合物的溶解;但是當(dāng)微波功率繼續(xù)增大后,使得局部溫度也逐漸開始升高,導(dǎo)致了細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞[14],從而導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)的破壞,進(jìn)而使提取量減小.由此得出,提取仙人掌果皮黃酮的最佳微波功率為200 W.

2.1.2 超聲波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

圖2 超聲波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定微波功率200 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇濃度65%、提取時間40 min、提取溫度60 ℃,測定不同超聲波功率對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,結(jié)果見圖2.

圖2顯示仙人掌果皮黃酮提取量的變化趨勢為逐漸增加后減少.當(dāng)超聲波功率達(dá)到600 W,黃酮提取量最高可以達(dá)到9.48 mg·g-1.這是因?yàn)殡S著超聲波功率逐漸增加,由于超聲波的作用使得細(xì)胞內(nèi)的黃酮連續(xù)溶解,超聲波功率再繼續(xù)增大,過大的超聲波破壞了細(xì)胞壁[15],從而使得黃酮的提取率越來越少,超聲波功率再繼續(xù)增大會繼續(xù)使仙人掌果皮細(xì)胞組織破碎變形,此時黃酮幾乎全部被提取出來,提取率也不再增加.所以提取仙人掌果黃酮最佳的超聲波功率為600 W.

2.1.3 提取時間對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

圖3 提取時間對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定微波功率200 W、超聲波功率600 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇濃度65%、提取溫度60 ℃,測定不同提取時間對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,結(jié)果見圖3.

圖3顯示,黃酮的提取量隨著提取時間的推移逐漸增大然后再減小.當(dāng)提取時間達(dá)到30 min時,黃酮提取量達(dá)到最大為7.07 mg·g-1.提取的時間越長黃酮提取量越少,這可能是因?yàn)殡S著時間的推移,微波和超聲波二者對類黃酮的破壞作用產(chǎn)生疊加效果,破壞了黃酮的穩(wěn)定性,從而黃酮提取量也迅速減少.因此,仙人掌果皮黃酮的最佳提取時間為30 min.

圖4 料液比對與仙人掌果皮中黃酮提取量的影響

2.1.4 料液比對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定微波功率200 W、超聲功率600 W、提取時間30 min、乙醇濃度65%、提取溫度60 ℃,測定不同料液比對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,結(jié)果見圖4.

由圖4可知,當(dāng)料液比為1:10(g·mL-1)時,提取量達(dá)到最大9.38 mg·g-1.這是因?yàn)橄扇苏乒?nèi)所含黃酮量不比果肉那樣豐富,當(dāng)料液比為1∶10(g·mL-1)時萃取劑已經(jīng)很充足,使得細(xì)胞到達(dá)一個動態(tài)平衡的狀態(tài),物質(zhì)快速溶解流出,黃酮的提取率達(dá)到最高值,然后料液比再繼續(xù)增大,除黃酮外的其他雜質(zhì)也能溶解于乙醇當(dāng)中,這會導(dǎo)致黃酮的提取率的減少.所以,提取仙人掌果皮黃酮的最佳料液比為1∶10(g·mL-1).

圖5 提取溫度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

2.1.5 提取溫度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定微波功率200 W、超聲功率600 W、提取時間30 min、料液比1∶10 g·mL-1、乙醇濃度65%,測定不同提取溫度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,結(jié)果見圖5.

圖5顯示,溫度為60 ℃黃酮的最大提取量為6.83 mg·g-1,初期,黃酮在乙醇中的溶解度會跟著溫度的升高而增加,提取劑的擴(kuò)散系數(shù)也在跟著溫度的升高而增加,這促使了提取速度的加快,過高的溫度會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞[16],也容易氧化黃酮類化合物,并且其他雜質(zhì)物質(zhì)也逐漸增多,所以,仙人掌果皮黃酮的最佳提取溫度為60 ℃.

2.1.6 乙醇濃度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

圖6 乙醇濃度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響

固定微波功率200 W、超聲功率600 W、提取時間30 min、料液比1∶10 g·mL-1、提取溫度60 ℃,測定不同乙醇濃度對仙人掌果皮黃酮提取量的影響,結(jié)果見圖6.

如圖6所示,當(dāng)提取劑乙醇的濃度為55%時,黃酮的最大提取量達(dá)到9.15 mg·g-1.黃酮提取量隨著乙醇濃度的增大,過高濃度的提取劑中黃酮類化合物不能充分溶解[17];另一方面是因?yàn)檫^高濃度的酒精使細(xì)胞中蛋白質(zhì)凝固,凝聚堵塞組織微孔,阻礙了黃酮的溶出,故提取率下降[18],試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇的濃度優(yōu)選為55%.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

選取單因素中對黃酮提取量影響較大的微波功率、超聲功率、乙醇濃度、料液比進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),結(jié)果見表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

極差分析結(jié)果表明,四個因素影響實(shí)驗(yàn)的幅度排列順序?yàn)镈>C>B>A,仙人掌果皮中黃酮類物質(zhì)的最佳提取條件為A2B1C3D1,即:微波功率為200 W時,超聲波功率設(shè)置為480 W,乙醇濃度為60%,料液比為1∶8(g· mL-1),經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在此條件下仙人掌果皮黃酮的提取量為14.73 mg·g-1.

2.3 光學(xué)性質(zhì)研究的結(jié)果與分析

2.3.1 紫外-可見吸收光譜掃描

仙人掌果皮黃酮紫外-可見光譜掃描結(jié)果見圖7.

圖7 仙人掌果皮中黃酮的紫外-可見光譜掃描圖

通常,大部分的黃酮類物質(zhì)在紫外-可見吸收光譜掃描中會出現(xiàn)兩個主要的特征吸收峰,峰I的具體波長范圍為300～400 nm,這一吸收峰的產(chǎn)生主要是由于黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)中的黃酮B環(huán)和環(huán)肉桂酰系統(tǒng),峰II 的具體位置為200～285 nm,該吸收峰主要是由于黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)中的黃酮A環(huán)和側(cè)鏈苯甲酰系統(tǒng)引起[19].圖7顯示,仙人掌果皮中黃酮物質(zhì)主要出現(xiàn)了兩個吸收峰帶,峰I的吸收峰處于330～380 nm之間,峰II的吸收峰處于235～250 nm之間,這兩個吸收峰帶與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁相似,符合黃酮類化合物的兩個特征吸收峰波長范圍內(nèi).其中吸收峰II更強(qiáng),峰I的吸收峰較峰II更寬且緩,這說明仙人掌果皮中黃酮類化合物的黃酮B環(huán)和環(huán)肉桂酰系統(tǒng)上的取代基成分種類較多.

2.3.2 紅外光譜掃描

仙人掌果皮黃酮紅外光譜掃描結(jié)果見圖8.

圖8 仙人掌果皮黃酮紅外光譜掃描圖

由圖8可知,仙人掌果皮總黃酮和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)多處吸收峰.在3 500～3 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)一個較強(qiáng)烈并且寬的吸收峰,仙人掌果皮總黃酮吸收峰值為3 423 cm-1,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為3 429 cm-1,二者很接近,這是由于O-H基(締合)的伸縮振動,說明了羥基的存在;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在波數(shù)為2 935 cm-1處的吸收峰和仙人掌果皮黃酮在波數(shù)為2 931 cm-1處的吸收峰為-CH2的反對稱伸縮吸收[19]引起;C=O基的伸縮振動吸收區(qū)域主要為1 850～1 660 cm-1波數(shù)范圍內(nèi),圖8中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和仙人掌果皮黃酮吸收峰出現(xiàn)在1 850～1 500 cm-1較小范圍內(nèi),這表明可能存在有酮類、醛類、酸類、酯類等化合物;在1 300～1 000 cm-1范圍內(nèi)有吸收峰揭示C-O的伸縮振動,可判斷有C-O鍵的存在;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在781 cm-1處和仙人掌果皮黃酮在777 cm-1處的吸收峰是由苯環(huán)間位取代的面外變形振動引起[20].蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和仙人掌果皮黃酮的紅外光譜吸收有基本相似,初步判斷仙人掌果皮總黃酮為黃酮醇.

3 結(jié)論與討論

超聲微波協(xié)同萃取仙人掌果皮黃酮的最佳提取工藝條件為:微波功率為200 W,超聲波功率為480 W,料液比為1∶8(g·mL-1),乙醇濃度為60%,黃酮提取量為14.73 mg·g-1.仙人掌果皮黃酮提取物紫外-可見吸收光譜掃描在230～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,出現(xiàn)的兩個吸收峰帶,與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品特征吸收峰一致;紅外光譜掃描在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,可判斷仙人掌果皮總黃酮應(yīng)該是黃酮醇.

Faten M等[21]研究了埃及仙人掌果皮的乙醇提取物中含有的多酚、黃酮類活性成分,具有抗氧化和抗癌活性,本研究發(fā)現(xiàn),三亞本地產(chǎn)仙人掌果皮的黃酮成分也具有良好應(yīng)用基礎(chǔ),如海南日照強(qiáng)度大,皮膚易受陽光的紫外線輻射,研究發(fā)現(xiàn) UVA 320～400 nm,對人體皮膚作用緩慢,但可致皮膚曬黑,所以又稱“曬黑段”[22].仙人掌果皮黃酮在330～380 nm之間出現(xiàn)的峰I吸收峰,揭示如果將仙人掌果皮黃酮添加到防曬產(chǎn)品中,具有防止皮膚被紫外線曬黑的潛在功效.