HIF1α-shRNA表達載體的構建與鑒定

李正堃 李慧瑾

摘 要

目的：構建 HIF1α-shRNA表達載體并鑒定，為進一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。方法：設計合成兩條互補的編碼HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸單鏈，退火形成互補雙鏈，后將退火產物與酶切線性化的表達載體pG1.1連接后，轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，提取重組質粒并酶切鑒定，挑取克隆正確的重組質粒去測序鑒定插入序列。結果：重組質粒酶切結果顯示退火片段連接到pG1.1載體里，經測序分析重組質粒插入序列與合成的寡核苷酸序列一致。結論：HIF1α-shRNA表達載體構建成功，為后續(xù)研究提供基礎。

關鍵詞

HIF1α;shRNA;載體構建

中圖分類號： Q78;R378.11 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.062

缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1， HIF-1）最初是從缺氧誘導的肝癌細胞Hep3B的細胞核中發(fā)現(xiàn)的一個轉錄因子，由氧敏感的α 亞基（HIF-1α）和持續(xù)穩(wěn)定表達的β亞基（HIF-1β）以異源二聚體的形式組成，HIF-1α是調節(jié)亞單位，決定HIF-1的活性，HIF-1β則與穩(wěn)定HIF-1及其二聚化有關[1]。已經證實，HIF-1可介導腫瘤細胞產生一系列的缺氧適應反應，與腫瘤細胞的糖酵解途徑密切相關，使腫瘤細胞在相對缺氧的狀態(tài)下獲得更多的能量供應，以維持存活、生長和分裂[2]。本研究將構建HIF1α-shRNA表達載體，為進一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供生物學基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

表達載體pG1.1（武漢巴菲爾），限制性內切酶BsaI、SacI （美國NEB），T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、感受態(tài)細胞DH5α（北京天根），DNA寡核苷酸由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 序列設計合成

已驗證有效干擾HIF1α表達的siRNA正義鏈序列為5'-GCCTCTTTGACAA

ACTTAA-3'，依據(jù)pG1.1載體的插入位點和接頭結構，設計合成兩條互補的編碼HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸單鏈，結構為BsaI +Sense+Loop+Antisensecomplement+終止信號+SacI+BsaI，具體序列見表1。

1.2.2 載體酶切回收

用BSAI完全酶切pG1.1載體，1%瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為線性化載體。酶切體系如下：pG1.1 2μg，BsaI 2μl，10×buffer 4μl，100×BSA 0.4μl，H2O補足40μl，37℃水浴酶切過夜，酶切結果見圖1。

1.2.3 退火形成雙鏈

分別用30μl annealing buffer溶解2OD兩條互補DNA寡核苷酸單鏈，各取2μl，加16μl annealing buffer混勻，94℃退火自然冷卻至室溫，各取1μl退火產物加99μl H2O做100倍稀釋。

1.2.4 載體連接轉化

連接反應體系如下：稀釋退火片段1μl，線性化載體1μl，5×Ligase Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，H2O 5μl，4℃反應過夜。取10μl連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含Kana抗性（終濃度為30ug/ml）的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上挑取數(shù)個單克隆菌落接種于5ml含Kana抗性（終濃度為30ug/ml）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。

1.2.5 載體鑒定

提取重組質粒并分別用SacI做酶切鑒定，酶切體系如下：DNA 8.5μl，10 ×Buffer 1μl，SacI 0.5μl，37℃水浴反應2h，1%瓊脂糖凝膠電泳，挑取克隆正確的重組質粒去測序鑒定插入序列。

2 結果

因為載體pG1.1里面本來只有一個SacI的酶切位點，但是重組質粒能夠被SacI酶切出一條約900bp DNA條帶，說明退火片段連接到pG1.1載體里，酶切結果見圖2。經測序分析重組質粒插入序列與合成的寡核苷酸序列一致，HIF1α-shRNA表達載體構建成功，測序比對結果見圖3。

3 討論

研究證明絕大多數(shù)實體腫瘤組織中存在缺氧微環(huán)境，這一刺激因素能增強腫瘤細胞抗凋亡能力、促進腫瘤血管生長、增加腫瘤對化療藥物耐受性，從多方面加速腫瘤的惡性進展，尤為重要的是缺氧能誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮至關重要的作用[3]。腫瘤細胞對缺氧刺激的反應體現(xiàn)在下游靶基因的表達變化而影響細胞的生物學功能，而調控這些差異表達基因的最為重要的轉錄因子就是HIF[4]。

HIF轉錄因子包括HIF1、HIF2和HIF3，它們在缺氧環(huán)境中發(fā)揮各自不同的功能，其中HIF1已被證實參與調控腫瘤侵襲轉移、血管形成、糖酵解等過程，并與卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤不良預后密切相關[5]。HIF1由α及β兩個亞基聚合活化后才能入核調控下游靶基因的表達。HIF1α蛋白的氧依賴性降解區(qū)（oxygen-dependent degradation domain，ODD）脯氨酸在常氧條件下會被羥基化，使得HIF1α蛋白進入E3泛素連接酶VHL（Von Hippel Lindau）介導的泛素化降解途徑，而β亞基（也被稱為芳香烴受體核轉位蛋白，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）為組成性表達，可穩(wěn)定存在。在缺氧條件下，穩(wěn)定的HIF1α與β亞基結合形成二聚體后入核，HIF1蛋白可作為轉錄因子募集CBP和p300結合到下游靶基因啟動子或增強子中的HRE上，激活靶基因的轉錄[6]。因此，HIF1α的穩(wěn)定性決定了HIF1的生物學功能的發(fā)揮。

本研究構建了HIF-1α-shRNA表達載體，經酶切和測序鑒定證實構建成功。該表達載體在細胞內轉錄生成shRNA后，通過Dicer酶剪切生成siRNA，從而干涉HIF-1α表達。該表達載體為后續(xù)研究HIF-1α的功能提供基礎，可以瞬時干涉HIF-1α進一步篩選后得到穩(wěn)定表達細胞株，觀察缺氧環(huán)境下腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等改變，從而更深入認識HIF-1α對腫瘤細胞的生物學作用。

參考文獻

[1]Semenza GL， Wang GL.A nuclear fact or induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoiet in gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol， 1992; 12：5447-5454.

[2]Denko N C. Hypoxia ， HIF1 and glucose metabolism in t he solid tumour[J]. Nat Rev Cancer， 2008 ，14：1474-1478.

[3]Jiang J， Tang YL， Liang XH. EMT： a new vision of hypoxia promoting cancer progression[J].Cancer Biol Ther，2011，11（8）： 714-723.

[4]Tsai YP， Wu KJ. Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis. Journal of biomedical science， 2012，19：102.

[5]Tang CM， Yu J. Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer. J Gastroenterol Hepatol， 2013，28（3）：401-405.

[6]Greer SN， Metcalf JL， Wang Y， Ohh M. The updated biology of hypoxia-inducible factor. EMBO J，2012，31（11）：2448-2460.