MBL基因單核苷酸多態性分布與類風濕性關節炎易感性相關性的研究

侯玲 王玉娜 周永忠

摘 要

[目的]分析MBL基因啟動子區-221G/C、-550G/C SNP位點在寧夏地區的分布特征，并探討其與類風濕性關節炎（RA）發病的相關性。[方法]采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶鏈式反應-序列特異性引物（PCR-SSP）技術，對400名寧夏健康個體及380名RA患者MBL-221G/C、MBL-550G/C進行基因分型。[結果]（1）RA患者中：MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統計學差異（P>0.05）。（2）在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-550G/C基因型頻率和等位基因頻率分布均存在統計學差異（P<0.05）。[結論]（1）RA的發病在MBL-221和MBL-550多態位點不受年齡、性別、的影響。（2）MBL-550位的C等位基因可能是寧夏地區RA發生的危險因子。

關鍵詞

寧夏;甘露糖結合凝集素;單核苷酸多態性;類風濕性關節炎

中圖分類號： R593.22 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.057

Abstract

[Objective] To determine the distribution of Mannose-Binding Lectin（MBL）gene polymorphism in ?Ningxia，To study on the influence of MBL genepolymorphism in RA. [Methods]By using PCR-RFLP and SSP-PCR， we determined MBL genotype and haplotype of MBL-221G/C、MBL-550G/C in 400 healthy people which from Ningxia district， 380 RA patients of Ningxia district. [Results]（1）At MBL-221G/C and MBL-550G/C， There were no statistically significant differences of nation、sex and age in either the frequency of genotypeor that of allele in MBL genepolymorphism of RA patients（P>0.05）. （2）At MBL-550G/C， there were statistically significant differences in MBL genepolymorphism genetictype frequencies between RA patients and healthy（P<0.05）.[Conclusion]（1）The onset of RA is not affected by age ，gender and ethnicity. （2）At MBL-550G/C， C allele probably is one of the risk factors which may lead to RA disease in Ningxia district.

Key words

Ningxia;MBL;SNP;RA

1975年，人們發現哺乳動物細胞內可能存在一種能與甘露糖特異結合的蛋白質，1978年，Kawasaki T等[1]的研究證實這種蛋白質的存在，隨后將此蛋白質命名為甘露糖結合凝集素（MBL），并建立了MBL的cDNA克隆。人MBL基因全長7kb，位于第10號染色體長臂10q11.2-q21。種族、民族、年齡、應激狀態、基因變異及多態性等多種因素都會影響MBL血清水平[2]。其中結構基因外顯子Ⅰ密碼子點突變和啟動子區SNP的調控對MBL血清濃度影響最大[3]。由于啟動子區呈現出單核苷酸多態性（SNP），對MBL基因的轉錄進行調控，從而使不同種族之間、甚至同一種族不同個體間的MBL血清水平差異顯著[4]。

類風濕性關節炎（RA）是一種病因不明的、以關節疼痛、腫脹、畸形為主要臨床特征的慢性全身性疾病，是遺傳因素與環境因素共同作用的多基因疾病。許多研究表明，MBL基因可能是影響RA疾病發病的候選基因[5-8]。本課題組在研究MBL基因外顯子Ⅰ密碼子點突變與寧夏地區RA相關性的基礎上，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶鏈式反應-序列特異性引物（PCR-SSP）技術檢測MBL基因啟動子區SNP位點多態性在寧夏地區的分布特征，并探明其與RA的發病是否存在相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源及處理

基因組DNA樣本來源于寧夏不同地區。健康對照400例，來源于寧夏不同地區體檢健康人群，年齡在7歲-73歲之間，其中男性210例、女性190例。RA患者380例，樣本來源于住院患者，RA的診斷以美國風濕病學會（ARA）1987年修訂的RA分類標準為依據，年齡在7歲-77歲之間，其中男性190例、女性190例。以上研究個體均無血緣關系，追溯3代均為同一民族個體，且在寧夏地區居住3代以上。根據知情同意原則，常規抽取所選個體的外周靜脈血2ml，加入0.2mlACD抗凝劑，充分混勻，進行DNA提取，之后加入100μl的DNA水化液完全溶解DNA，-20℃保存備用。

1.1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒（北京天根公司），電泳級瓊脂糖（上海生工生物工程技術服務有限公司），PCR引物由上海英駿生物有限公司合成，限制性內切酶MspI購自大連寶生生物公司。PCR反應試劑包括：5×PCR反應液、2.5Mm dNTP及LA Taq DNA聚合酶（5U/μl）。丙烯酰胺溶液（Acr：Bis=29：1），分子大小標準物：MarkerⅠ、2000bp DNA Marker。硝酸銀染色試劑。瓊脂糖凝膠電泳試劑包括1×TAE電泳緩沖液、電泳上樣緩沖液、0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）。

臺式高速離心機（Eppendrof，Germany），MycycleTM Thermal Cycler型PCR儀（BIORAD公司）。DYY-8B型穩壓電泳儀，DYY-32A型水平電泳槽，DYCZ-24A型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。凝膠電泳圖像分析系統（Bio-Rad，U.S.A）。

1.2 方法

1.2.1 RFLP-PCR法檢測MBL-221G/C、SSP-PCR法檢測MBL-550G/C

根據全基因組PCR的引物設計原則，利用Primer Primer5.0軟件，自行設計PCR引物，MBL-221引物序列為：F： 5' –CGGTCCCATTTGTTCTCACTGCCCC-3'，R： 5'- TGTGACACTGCGTGACTA-3'。MBL-550引物序列為：-550c： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT C-3，-550g： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT G-3，-550： ?5-CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3。

PCR總反應體系為15μl， PCR反應條件：94°C預變性4分鐘后進入循環，每個循環為：94℃變性30秒，63℃（MBL-221位點）、60℃（MBL-550位點）退火30秒、72℃延伸1.5分鐘，共循環30個周期，最后在72°C延伸10分鐘。MBL-221位點PCR產物為152bp，MBL-550位點PCR擴增產物為884bp。

擴增反應結束后，取PCR產物3μl與0.5μl電泳上樣緩沖液混勻，依次上樣于2%的瓊脂糖凝膠中，以2000bp DNA Marker做參照，電泳30分鐘后，將瓊脂糖凝膠用0.5μg/ml的溴化乙錠染色15-20分鐘，然后用蒸餾水漂洗2次，紫外燈下判讀PCR擴增情況和MBL-550位基因型。樣本DNA的PCR擴增產物在 Marker兩側有兩個泳道，若Marker左側泳道未出現DNA條帶而右側出現DNA條帶則為野生純合子GG，若Marker左側泳道出現DNA條帶而右側未出現DNA條帶則為突變純合子CC，若Marker左側泳道出現DNA條帶同時右側也出現DNA條帶則為雜合子GC。

然后將MBL-221位點PCR擴增產物進行MspI內切酶酶切，總反應體系為10μl， 37℃水浴酶切1～2h。酶切產物經8%非變性凝膠電泳和硝酸銀染色，用凝膠電泳圖像分析系統分析結果并記錄其基因型，野生純合子GG（127bp，25bp），突變純合子CC（152bp），雜合子GC（152bp，127bp，25bp）。

1.2.2 統計學方法

研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度用？字2檢驗;MBL基因型頻率與等位基因頻率采用頻率計數法，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用？字2檢驗。均應用SPSS統計軟件進行統計，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MBL-221 RFLP-PCR結果、MBL-550 SSP-PCR結果

在寧夏地區健康對照和RA患者中，均檢出MBL-221和MBL-550位點具有單核苷酸多態變異。

2.2 寧夏地區MBL基因單核苷酸多態性分布特征及其與RA相關性

對健康對照的？字2檢驗結果顯示，本研究人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），具有群體代表性。在分析健康對照和RA患者MBL-221、MBL-550位點多態性時，進行了性別和年齡分組，年齡段分組依據聯合國世界衛生組織提出的年齡分段標準，44歲以下為青年人，45歲以上為中老年人。

2.2.1 寧夏RA患者MBL-221、MBL-550位點多態性

MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統計學差異（P>0.05）（表1，表2）。

2.2.2 寧夏健康對照和RA患者MBL基因頻率和等位基因頻率的比較

在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-221G/C的基因型頻率和等位基因頻率在兩組間的比較中均無統計學差異（P<0.05）（表3）。MBL-550G/C基因型頻率在兩組間存在統計學差異（P<0.05），MBL-550位點C等位基因頻率在RA中的分布高于對照組，其差異性具有統計學意義（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）（表4）。

3 討論

我國類風濕性關節炎（RA）患病率約為0.3%，患者人數超過了500萬，本病是造成我國人群喪失勞動力，甚至致殘的主要病因之一，嚴重影響人們的生活質量并加重家庭經濟負擔。血清MBP作為一種急性反應蛋白會受RA疾病本身的影響，而研究MBL基因單核苷酸多態性與RA相關性的優勢在于MBL多態性不受RA病程的影響。因此，探討MBL基因作為影響RA疾病發病候選基因的可能性并對其進行群體遺傳結構分析，在篩選RA易感人群，并采取有效的預防和治療措施等方面都具有潛在的應用前景。RA是遺傳因素與環境因素共同作用的多基因疾病，關于MBL基因單核苷酸多態性與RA的可能聯系研究較多，許多研究結果表明MBL和RA的發生和發展可能存在相關性[5-8]。本課題組采用PCR-SSP和PCR-RFLP檢測技術研究了MBL基因啟動子區MBL-221G/C、MBL-550G/C兩個SNP位點多態性分布特征及其與寧夏地區RA發病的相關性。在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-221G/C的基因型頻率和等位基因頻率在兩組間的比較中均無統計學差異（P>0.05）。因此，在寧夏地區，MBL-221位單核苷酸多態性可能與RA的發病不具有相關性。Ip[9]等對中國南方RA病人與健康對照的MBL表型、基因型及啟動子多態性進行研究發現，啟動子區第550位多態性在兩組間差異顯著，RA病人血清中MBL水平顯著低于健康對照。本研究結果顯示，MBL-550G/C基因型頻率和等位基因頻率在兩組間存在統計學差異（P<0.05），RA患者變異純合基因型CC頻率顯著高于健康對照（P=0.009），MBL-550位變異型C等位基因頻率在RA中的分布高于對照組，其差異性具有統計學意義（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）。此研究結果提示，MBL-550位單核苷酸多態性可能與寧夏地區RA的發病具有相關性，MBL-550位變異型C等位基因可能是寧夏地區RA發病的候選基因。比較中國南方和北方寧夏地區MBL-550位點的多態性變異和與RA疾病的相關性，結果是一致的。

對RA患者的研究結果顯示，MBL-221G/C、MBL-550G/C兩個位點的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同民族、不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統計學差異（P>0.05）。

綜上所述，本研究結果提示：RA的發病在MBL-221和MBL-550多態位點不受年齡、性別和民族因素的影響。MBL-221位點的多態性變異可能與寧夏地區RA發生不相關，而MBL-550位點的多態性與寧夏RA發病關系更為密切，其變異等位基C可能是寧夏地區RA發生的危險因子。RA是一種復雜的由多種遺傳因素和環境因素共同作用的自身免疫性疾病，MBL作為機體天然免疫的第一道防線，其生物學功能的重要性已被充分肯定，個體MBL基因變異，MBL血清水平低下或功能缺損，從而導致補體凝集素途徑的活化不足，在明確MBL缺損后，用外源性MBL治療已顯示出臨床應用價值。本研究結果可為針對性地治療RA提供依據，并提示在臨床工作中基于不同的基因型采取相應的干預措施。而有關MBL途徑活化補體系統和免疫調控的機制、MBL與細胞受體識別并結合的機制和調節作用等問題，本課題組會在前期工作的基礎上做進一步的深入研究，以期可以對于RA的早期診斷、預防和治療提供思路。

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