血清類風濕因子對免疫比濁法測定甘膽酸的影響評估

任 鵬,谷 春,李建立,劉貴建

(中國中醫科學院廣安門醫院檢驗科，北京 100055)

甘膽酸為膽酸的主要成分，可早期靈敏地反映肝膽功能的異常，是診斷肝細胞損傷和肝內膽汁淤積癥的特異和靈敏的實驗指標[1-3]，對肝膽疾病有診斷、鑒別診斷意義，并為肝膽疾病的預后分析提供重要依據[4]。類風濕因子是一種自身抗體，存在于類風濕關節炎、硬皮病、肝炎等患者的血清中[5]。在臨床檢驗工作中發現，在某些類風濕因子水平較高患者的血清中其他肝膽指標均正常而甘膽酸異常降低；或者肝炎患者肝功檢測結果明顯異常但甘膽酸檢測結果卻正常。此種情況下甘膽酸的異常低值是真實反映肝膽功能還是由于受到干擾而出現的假陰性結果？如何判斷其真實性？在臨床工作中，某些未可預知的干擾會對臨床檢測結果造成明顯影響，誤導醫生對患者的診斷和病情判斷，形成了醫療安全方面的隱患。本文擬通過在標本中添加不同水平類風濕因子，驗證較高水平的類風濕因子是否會干擾血清甘膽酸的檢測，導致甘膽酸檢測結果假性降低，同時平行實驗觀察另一種自身抗體抗核抗體對甘膽酸檢測的干擾情況，作一定的對比驗證。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集臨床檢測到的含高水平類風濕因子患者的血清樣本(類風濕因子>10 000 IU/mL)，同時收集不同水平的甘膽酸血清樣本,水平區間為3.33～58.65 mg/L；收集高滴度抗核抗體標本，涵蓋核心型、著絲點型、均質型、顆粒型和混合型，同步進行干擾試驗。

1.2儀器與試劑 類風濕因子測定：Beckman Coulter IMMAGE800 特種蛋白分析儀，Beckman Coulter 類風濕因子檢測試劑盒(免疫比濁法)，標準品和質控品均為Beckman Coulter同批次產品。血清甘膽酸測定：Beckman Coulter AU5821全自動生化分析儀,寧波美康公司的甘膽酸測定試劑盒(膠體金增強免疫法)，標準品和質控品均為寧波美康公司同批次產品。進行實驗前，儀器已按照規定進行維護和校準，各項性能指標符合要求，整個實驗操作過程中，嚴格執行實驗室制訂的質量控制程序和檢驗操作規程，并以質控品進行常規質量控制，監控整個分析操作過程。

1.3分組方法 選取符合條件的樣本進行試驗。每份樣本取血清2 mL，對照樣本組和干擾物組各1 mL,均分為10份，對照組分別添加0、100 μL生理鹽水；干擾物組分別添加0、150、322、545、789、1 915、3 300、4 200、5 500、11 400 IU/mL類風濕因子血清100 μL，混勻后檢測血清甘膽酸水平。每個樣本測定2次取平均值作為檢測結果，除“0添加樣本”外，其余樣本檢測結果乘以2。同時選取含高滴度抗核抗體的血清樣本進行同樣操作，觀察抗核抗體對甘膽酸測定的影響。

1.4統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 不同水平類風濕因子干擾下甘膽酸檢測結果(mg/L)

圖1 干擾整體趨勢

表2 不同類型高滴度抗核抗體干擾下甘膽酸檢測結果(mg/L)

2 結 果

2.1甘膽酸處理前后的檢測結果差異 經類風濕因子處理前后各樣本甘膽酸檢測結果見表1。生理鹽水稀釋的標本前后差異無統計學意義(P>0.05)。類風濕因子處理前后血清甘膽酸檢測結果比較：添加類風濕因子后的血清再次檢測甘膽酸水平，部分結果出現明顯下降。處理前后數據進行比較，11 400 IU/mL水平干擾下，檢測結果之間差異有統計學意義(t=10.19,P=0.000);5 500 IU/mL水平干擾下，檢測結果之間差異有統計學意義(t=7.09,P=0.002)。

2.2高濃度水平RF的干擾差異 血清甘膽酸的下降幅度與類風濕因子的水平有關，但不成正比。類風濕因子在4 200 IU/mL時，甘膽酸檢測結果在10 mg/L以上的樣本偏差已經超過15%，類風濕因子在5 500 IU/mL以上的所有樣本，甘膽酸檢測結果均超過原始檢測結果15%，原則上結果不能審核發放。見圖1。

2.3不同水平甘膽酸抗干擾的差異 原水平越低的甘膽酸樣本，受高水平類風濕因子干擾越嚴重，抗干擾能力越低。類風濕因子在5 500 IU/mL 水平時，甘膽酸小于15 mg/L的樣本，檢測結果不足實際水平的10%；大于40 mg/L的樣本，檢測結果約為實際結果的25%，兩者之間差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4低濃度水平RF的干擾差異 試劑說明書給出的建議是類風濕因子<150 IU/mL時對甘膽酸測定無干擾。分析檢測數據可發現類風濕因子水平在545 IU/mL時，雖然有干擾，但結果仍然可以接受；而超過789 IU/mL時，偏差具有統計學意義，需要臨床關注。

2.5未觀察到抗核抗體對甘膽酸檢測的干擾 抗核抗體平行試驗并未觀察到對甘膽酸檢測的干擾,檢測結果之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

本研究結果顯示，經類風濕因子處理后的血清甘膽酸檢測水平均有不同程度降低，尤其是類風濕因子極高的樣本，血清甘膽酸檢測水平下降明顯，表明血清中較高水平的類風濕因子會干擾甘膽酸的測定，導致血清甘膽酸假性降低。干擾的機制可能是因為類風濕因子結構復雜，在機體中以多種分子結構型存在，其理化性狀、表位種類及數目等均可影響抗原抗體反應。人體內IgG分子由于某些原因常相互聚集，產生抗原多價性，這也促進了類風濕因子與IgG分子或抗原抗體復合物的結合。但不同試劑盒甘膽酸抗體的來源不一，其結合特異性不能保證一致，因此，不同廠家試劑盒干擾程度很可能有所差異，這有待于進一步的實驗觀察。此外，類風濕因子的亞型有IGG、IGA、IGM、IGE型，結構差異也有可能導致干擾程度的不同。

由于試劑研發和制備技術的發展，非特異性抗體引起的分析干擾發生率已經明顯下降，但免疫測定過程中的干擾仍不可避免，需要臨床和檢驗科保持警惕。本次實驗中，針對抗核抗體，亦進行了高滴度抗核抗體對甘膽酸測定的干擾測試，結果顯示核心型、著絲點型、均質型、顆粒型和混合型均未對免疫比濁法檢測甘膽酸的結果產生影響。分析其原因可能是抗核抗體主要以IgG型居多，而類風濕因子以IgM型居多，故初步可以判斷IgG型抗核抗體可能不會對甘膽酸檢測造成干擾。

類風濕因子作為自身免疫性抗體，在多種疾病中都有高水平存在的案例[6-7]，尤其是嚴重肝損害時，類風濕因子也常常升高。臨床實驗室在下列情況時應考慮是否有類風濕因子干擾物的存在：患者產生類風濕因子可能性的病史或與類風濕因子產生有關的疾病；臨床醫生根據其他的臨床檢驗數據懷疑肝膽功能損傷。在這種情況下實驗室能通過直接測定類風濕因子的水平監測干擾物的存在，若結果正常，則可以排除類風濕因子干擾的可能；血清甘膽酸異常降低的結果可懷疑由類風濕因子引起的甘膽酸假性降低，這類標本可先進行預稀釋處理，根據研究數據顯示，稀釋類風濕因子水平至545 IU/mL以下時，類風濕因子對甘膽酸測定結果的影響基本可以忽略。檢驗人員審核甘膽酸結果時，可參考丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的檢測結果。一般ALT、AST超出檢測上限3倍的患者，甘膽酸結果會出現一定升高；嚴重肝病患者總膽汁酸和甘膽酸比值(TBA/CG)常常大于4,若臨床結果不符，可初步判斷甘膽酸檢測受到干擾。此類標本需經過處理后重新測定，方可審核發放報告。

分析所有甘膽酸檢測反應曲線，均為X軸10點處開始反應，27點處達到最高，且曲線路徑基本一致，無明顯差異；所有讀點結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，干擾并未對檢測曲線造成影響。因此，單純分析反應曲線預計無法區分判斷干擾情況。

類風濕因子對免疫法檢測系統的負干擾，在一些文獻中被提出，但進行詳細研究的報道較少。干擾機制的研究，目前主要是空間位阻(屏蔽)假說，即當類風濕因子只能與捕獲或信號抗體中的某一種抗體結合時，會形成空間位阻(屏蔽)，阻礙捕獲抗體-抗原-信號抗體復合物的形成，造成檢測信號的減弱或缺失，引起假性降低或假陰性的檢測結果[8]。

在檢測前可以進行預處理盡可能降低樣本中的類風濕因子水平，以便消除或降低類風濕因子對檢測系統的干擾。試驗中常用的樣本預處理方法包括：使用阻斷試管采集檢測樣本[9]；分析前在樣本中加入動物血清或IgG[10]或加入封閉阻斷試劑[11];使用聚乙二醇6000[12]處理樣本；用包被IgG的固體顆粒吸附[13]等，盡管這些方法在降低類風濕因子干擾檢測方面被證實是有效的，且其中一些方法也較為簡單實用，但這些預處理方法已被證實并不是對所有類風濕樣本都有效[9-10，12]。價格較高的蛋白L沉淀[14]，由于性價比問題，基本不可能用于臨床試驗當中。部分文獻認為可以通過添加還原劑2-巰基乙醇降解，使用聚乙二醇沉淀法預吸收[15]，或者重組單克隆抗體IgY作為試劑抗體等方法降低類風濕因子的干擾作用[16]，本次試驗由于條件所限，并未進行相關驗證。

4 結 論

綜上所述，類風濕因子水平在545 IU/mL以下時，對甘膽酸檢測結果基本無影響，當類風濕因子水平大于545 IU/mL時，則會干擾甘膽酸的測定，導致甘膽酸檢測結果較實際血清水平低，需要引起臨床重視。結果審核時應結合血清ALT、AST、總膽汁酸綜合分析報告血清甘膽酸結果。