血清微小RNA Let-7a表達水平對兒童哮喘診斷及嚴重程度評估的價值

李 燚，李 蓉，賈 可，趙 軻

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院：1.兒科；2.胸外科，湖北武漢 430030)

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其特征是氣流可逆性阻塞、支氣管反應過度，臨床表現為反復發作的喘息、咳嗽和呼吸困難[1]。哮喘患者的免疫反應改變可歸因于遺傳和表觀遺傳改變。微小RNA(miRNA)是短鏈非編碼的RNA分子，高度保守并通過靶向mRNA致mRNA降解、切割或抑制蛋白質翻譯來控制基因表達過程，參與細胞分化、增殖、凋亡和細胞因子調節[2]。在過敏性氣道疾病中，miRNA的作用主要通過影響一般炎癥和組織反應細胞因子表達而實現[3]。

miRNA Let-7屬于由12個基因組成的高度保守的miRNA家族，其編碼9種不同的RNA分別命名為Let-7a至let-7i，let-7家族在肺臟中表達水平最為豐富[4]。Let-7a通過直接靶向白細胞介素(IL)-13轉錄物的3′UTR來抑制IL-13表達，調節IL-13分泌并由此調節氣道過敏性炎癥[5]。IL-13主要由Th2細胞分泌，是參與過敏性炎癥和哮喘的細胞分子[6]。兒童哮喘狀態下血清IL-13 水平增加，參與支氣管高反應性、幾丁質酶上調等病理生理過程[7]。盡管如此，哮喘兒童血漿Let-7a 表達水平尚無報道，本研究旨在探討兒童哮喘患者血漿Let-7a的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年3月至2018年3月于本院收治的過敏性哮喘兒童90例為哮喘組，其中男41例，女49例，年齡6～10歲。哮喘的診斷標準和嚴重程度參照全球哮喘倡議指南(GINA)[8]。并根據哮喘的嚴重程度分為輕度(41例)、中度(28例)、重度(21例)3個亞組。納入標準：(1)患者出現反復喘息和呼吸困難且診斷為哮喘；(2)吸入β2激動劑治療，肺功能檢測第1秒用力呼氣容積(FEV1)與吸入前相比增加12%；(3)皮膚點刺試驗陽性。排除標準：(1)患有心、肝和腎臟疾病；(2)患有與胸悶、劇烈呼吸和(或)咳嗽相關的其他肺病。根據肺功能檢查結果，采用FEV1水平評估哮喘的嚴重程度：輕度(FEV1>80%)、中度(FEV1 60%～80%)、重度(FEV1<60%)哮喘。選擇同期年齡和性別相匹配的沒有呼吸系統疾病或慢性病史的健康兒童90例為健康對照組，其中男40例，女50例，年齡6～10歲。本研究通過本院倫理委員會批準，并獲得所有參與研究兒童父母的知情同意。

1.2肺功能評估 使用便攜式兒科肺活量計(Masterlab Jaeger，Wurzberg，Germany)評估哮喘組中兒童的FEV1和用力肺活量(FVC)。肺功能測試的結果以預測的百分比表示。

1.3患者血液樣本收集 在完全無菌條件下從參與的兒童收集外周血樣品(4 mL)并分成兩部分：將2 mL收集至乙二胺四乙酸管中，然后將管離心10 min(1 900×g，4 ℃)，并將血漿小心地轉移到不含RNase的管中，然后再次離心10 min(12 000×g，4 ℃)。將另一部分(2 mL)在室溫下凝結30～60 min，然后離心10 min(1 000×g)以制備血清。將血漿和血清樣品儲存在-80 ℃直至進一步分析。

1.4測量血清IL-13水平 使用酶聯免疫吸附試驗測定商業試劑盒(Bender MedSystems，Heidelberg，Germany)按照制造商的說明測定人血清中的IL-13水平，評估靈敏度為1.50 pg/mL。

1.5實時熒光定量PCR檢測血清Let-7a表達水平 使用miRNeasy血清/血漿試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從血漿樣品中提取總RNA。分光光度計通過測量260和280 nm處的吸光度來確認提取的RNA純度和質量。根據制造商的說明書，使用miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen，Germany)通過反轉錄反應合成cDNA，并將cDNA儲存在-80 ℃直至使用。使用SYBR Green測定試劑盒(mi-ScriptSYBR?GreenPCR Kit和miScript Primer assay(Qiagen，Valencia，CA)在Stratagene Mx3000p系統(實時PCR系統，Agilent Technologies，Germany)中進行實時熒光定量PCR。反應混合物以20 μL的總體積進行，含有4 μL cDNA(100 ng/mL)、300 nmol/L引物和10 μL SYBR Green Master Mix，并用無核酸酶水完成至20 μL。熱循環條件如下：在95 ℃下初始變性5 min，然后在94 ℃變性40 s,退火15 s，并在72 ℃延伸10 s。選擇管家miRNA SNORD68(miScript PCR control，Qiagen，Germany)作為內部對照并采用2-ΔΔCt方法計算Let-7a的表達水平。Let-7a的實時熒光定量PCR的特異度引物：正向5′-GCA GTG AGG TAG TAG GTT G-3′；反向5′-GGT CCA GTT TTT TTT TTT TTT TAA CTA TAC-3′。管家小RNA(SNORD-68)用作內部對照，其引物序列為：正向5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；反向5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。每個病例樣本獨立重復測量3次，取平均值作為該樣本最終Let-7a表達水平。

2 結 果

2.12組一般臨床資料比較 哮喘組與健康對照組在年齡和性別上差異無統計學意義(P>0.05)。2組研究對象哮喘家族史、肺功能檢測(FEV1和FVC)之間差異有統計學意義(P<0.05)；哮喘組兒童血清IL-13水平顯著高于健康對照組(P=0.000)，哮喘組兒童Let-7a表達水平顯著低于健康對照組(P=0.000)。見表1。

表1 哮喘組與健康對照組一般臨床資料比較

2.2不同嚴重程度的哮喘患兒血清IL-13和Let-7a表達水平比較 外周血中IL-13水平隨哮喘嚴重程度顯著增加(P=0.000)，血清Let-7a表達水平隨哮喘嚴重程度顯著下降(P=0.000)。見表2。

2.3血清Let-7a表達水平的診斷價值 當最佳臨界值為2.09時，血清Let-7a診斷哮喘兒童的AUC為0.92(95%CI：0.87～0.95，P=0.001)，靈敏度和特異度分別為85.0%和90.0%；當最佳臨界值為1.60時，Let-7a區分重度和中輕度哮喘的AUC為0.80(95%CI：0.68～0.92，P=0.001)，靈敏度和特異度分別為75.0%和93.5%。見圖1。

表2 血清IL-13和Let-7a表達水平與哮喘嚴重程度的關系

注：A表示哮喘；B表示重度哮喘。

圖1 Let-7a表達水平的ROC 曲線

2.4Let-7a與IL-13、FEV1、FVC相關性分析 Pearson相關分析顯示，Let-7a的表達水平與IL-13水平呈負相關(r=-0.31，P=0.001)，見圖2A；Let-7a的表達水平與FEV1 呈正相關(r=0.270，P=0.004)，與FVC呈正相關(r=0.412，P=0.002)，見圖2B、C。

注：A表示Let-7a和IL-13水平相關性;B表示Let-7a和FEV1之間相關性;C表示Let-7a和FVC之間相關性。

圖2 Let-7a與IL-13、FEV1、FVC相關性分析

3 討 論

哮喘是嚴重影響小兒身心健康的常見呼吸道疾病，兒童哮喘的患病率及死亡率均有上升趨勢，我國存在1 000多萬哮喘患兒[9]。探討兒童哮喘相關血清非侵入性標志物對哮喘診斷和疾病嚴重程度的評估具有重要意義[10]。

miRNA是一大類小的調節分子，在各種細胞生命活動中發揮重要作用[11]。在哮喘發病過程中，miRNA通過調節Th2的存活、激活、增殖、分化和發育來控制過敏性免疫應答的強度[12]。本研究發現哮喘兒童Let-7a表達水平顯著性低于健康對照兒童，提示在兒童哮喘患者中，Let-7a表達受到抑制。隨著哮喘嚴重程度增加，血清Let-7a表達水平呈下降趨勢。ROC曲線分析表明，Let-7a表達水平可區分哮喘和健康兒童，研究結果提示血清Let-7a表達水平可作為哮喘患者診斷的生物標志物。ROC曲線分析顯示，血清Let-7a表達水平可以預測哮喘嚴重程度。本研究報道與文獻結果一致，哮喘患者血清中Let-7a表達水平降低[13]，同時在哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中分離出來的氣道上皮細胞中Let-7a表達水平也下降[14]。有文獻報道，與患有慢性阻塞性肺疾病的患者和健康對照組患者相比，哮喘患者呼出氣冷凝物中Let-7a miRNA表達較低[15]。通過miRNA微陣列分析檢查哮喘個體的支氣管肺泡灌洗液，發現Let-7a表達下調[16]。與輕度哮喘患者和健康對照組相比，嚴重哮喘患者的支氣管活檢發現氣道上皮細胞內Let-7a表達水平降低[17]。

本研究通過酶聯免疫吸附試驗法分析兒童哮喘患者血清IL-13水平，發現兒童哮喘患者血清IL-13水平顯著高于健康對照兒童，且隨著疾病嚴重程度增加而增加。嗜酸性粒細胞增多和Th2細胞因子(IL-13、IL-4和IL-5)分泌增加是哮喘患者氣道高反應性特征[18]。本研究發現，Let-7a表達水平與IL-13水平呈負相關，與FEV1和FVC呈正相關。有文獻報道，miRNA Let-7a可通過靶向性結合IL-13的信使RNA 3′UTR端，靶向抑制信使RNA翻譯過程，進而抑制IL-13的表達，降低IL-13在氣道上皮中的水平，減少氣道炎癥和氣道高反應性，具有阻止肺纖維化功能，其研究還發現哮喘小鼠模型中Let-7a表達在哮喘中的抗炎作用，可降低哮喘小鼠外周血T細胞誘導IL-13分泌[5]。在癌癥患者和特發性肺纖維化患者中也提出了Let-7a的抗炎作用[19]。本研究發現，兒童哮喘患者血清Let-7a表達水平與IL-13水平呈負相關，提示Let-7a表達可能通過抑制IL-13 產生而發揮抗炎和降低高反應性作用。Let-7a表達水平與肺功能參數(FEV1和FEV)呈正相關，確切原因尚不清楚，猜測可能與Let-7a表達水平降低氣道高反應性相關，需要進一步研究。

4 結 論

本研究結果顯示，哮喘兒童外周血中Let-7a表達水平顯著下降，其水平與疾病嚴重程度、IL-13水平和肺功能參數呈相關性。Let-7a可用作哮喘診斷和嚴重程度的非侵入性血清學生物標志物。