COX-2、Ki-67在前列腺癌組織中的表達及其臨床意義分析*

宋偉強，李哲賢，任志龍，董立軍△，李業山，陳國俊，張建坤，高 浩，張 航，辛澤昆

(河北中石油中心醫院：1.泌尿外科；2.保健與老年醫學科，河北廊坊 065000)

前列腺癌是一種常見的男性惡性腫瘤，好發于老年群體。隨著我國人口老齡化程度加劇和飲食結構的不斷變化，我國前列腺癌發病率呈不斷上升趨勢[1-2]。前列腺癌具有發病部位隱蔽、病因復雜及潛伏期長等特點，目前治療手段主要采用前列腺癌根治術、化學藥物、內分泌及放射治療等，其中早期手術是前列腺癌的根治手段，但通常確診時已屬中晚期，從而失去了最佳手術治療時機[3-5]。因此，尋求精確、有效的診斷方法或分子標志物對前列腺癌進行早期篩查和診斷意義重大。環氧化酶(COX)又稱為前列腺素H合成酶，參與機體的各種生理過程。臨床研究報道顯示，COX-2與前列腺癌發生、發展密切相關[6]。增殖細胞核抗原Ki-67是與細胞分泌及增殖有關的一種核蛋白，其在多種惡性腫瘤中表達[7]。目前關于COX-2和Ki-67在前列腺癌表達的相關報道較多，多聚焦于良惡性前列腺腫瘤組織蛋白和mRNA表達的差異性。本研究則探究COX-2和Ki-67在前列腺癌的表達及其與患者臨床特征的相關性，旨在為臨床診斷鑒別提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2017年1月至2019年6月收治的前列腺癌患者67例作為觀察組，年齡54～76歲，平均年齡(65.17±5.46)歲；體質量56～73 kg，平均體質量(62.78±5.25)kg；臨床分期(T分期)：≤T2a期19例，T2b期17例，≥T2c期31例；前列腺特異抗原(PSA)<10 ng/mL患者35例，10～20 ng/mL患者21例，>20 ng/mL患者11例。另選擇本院2017年1月至2019年6月收治的良性前列腺疾病患者81例作為對照組，年齡51～79歲，平均年齡(65.68±4.26)歲；體質量54～78 kg，平均體質量(63.24±6.46)kg。2組年齡和體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 主要儀器：光學顯微鏡(Leica公司)，CO2培養箱(ThermoFisher公司)，電泳儀(西安浦得儀器設備有限公司)，實時熒光定量PCR儀(長春博盛量子科技有限公司)。主要試劑：兔抗人單克隆抗體COX-2(北京中杉金橋生物技術開發有限公司)，兔抗人多克隆抗體Ki-67(北京中杉金橋生物技術開發有限公司)，DAB顯色劑(福州邁新生物試劑公司)，免疫組織化學SP試劑盒(福州邁新生物試劑公司)。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學法檢測COX-2和Ki-67表達 所有標本經4%甲醛固定，進行常規石蠟包埋，連續切片3～4 μm，采用二甲苯脫蠟梯度乙醇脫水。將切口放于10 mm、250 mL的檸檬酸緩沖液(pH值為6)中，再將其放于高壓鍋(100 ℃)中煮沸30 min修復抗原，按照免疫組織化學SP試劑盒標準操作，DAB顯示，蘇木精復染脫水，透明封固。結果判斷：于高倍鏡下取5個不同視野，分別計數200個細胞中陽性細胞數，每個標本陽性率取平均值計算。COX-2和Ki-67在細胞核和細胞質中表達情況分兩個維度評分，(1)著色程度：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐色與黑色計3分；(2)陽性細胞計數：≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%計4分。陽性細胞計數及著色程度評分相乘，所得結果<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量 所有標本提取總RNA，提取方法為經典的異硫氰酸胍法，嚴格依據總RNA抽提試劑盒標準操作，徹底干燥，溶解于20 μL DEPC 處理水中。取11 μL總RNA用于cDNA的合成，嚴格參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作，總反應體系為20 μL，將得到的cDNA置于-70 ℃條件下保存待測。取2 μL用于實時熒光定量PCR擴增。對COX-2和Ki-67 mRNA進行PCR反應條件的優化，檢測樣本COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量，以GAPDH mRNA作為內參，用2-ΔΔCt的相對定量法計算COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量。引物序列采用Primer Premier 6.0軟件自行設計。見表1。

表1 引物序列

1.3.3蛋白質印跡法檢測COX-2和Ki-67蛋白表達 所有標本加入細胞裂解液，勻漿裂解40 min，以10 000 r/min離心5 min，收集上清液進行蛋白定量。取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加入預測蛋白COX-2和Ki-67的抗體孵育1 h，再加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗孵育1 h，化學發光、顯影、定影，以β-actin蛋白作為內參。

2 結 果

2.12組COX-2和Ki-67陽性率比較 觀察組COX-2和Ki-67陽性率高于對照組(P<0.05)。見表2。COX-2、Ki-67在前列腺增生、前列腺癌組織中的表達情況見圖1、2。

表2 2組COX-2和Ki-67陽性率比較[n(%)]

注：A表示前列腺增生組織；B表示前列腺癌組織。注：白色箭頭表示COX-2陽性情況。

圖1 COX-2病理組織表達情況(×200)

注：A表示前列腺增生組織；B表示前列腺癌組織。注：白色箭頭表示Ki-67陽性情況。

圖2 Ki-67病理組織表達情況(×200)

2.22組COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量比較 觀察組COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組COX-2和Ki-67 mRNA相對表達量比較

2.32組COX-2和Ki-67蛋白表達比較 觀察組COX-2和Ki-67蛋白表達灰度值高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 2組COX-2和Ki-67蛋白表達灰度值比較

注：A表示β-actin；B表示COX-2;C表示Ki-67。

圖3 COX-2和Ki-67蛋白表達圖

2.4COX-2和Ki-67表達與前列腺癌臨床病理特征的關系 COX-2、Ki-67陽性表達與臨床T分期、淋巴結轉移及血清PSA水平關系密切(P<0.05)。見表5。

表5 COX-2和Ki-67陽性表達與前列腺癌病理特征的關系[n(%)]

續表5 COX-2和Ki-67陽性表達與前列腺癌病理特征的關系[n(%)]

3 討 論

前列腺癌具有典型的異質性，通常一些前列腺癌早期癥狀較為隱秘，且疾病發展較慢；而部分發展較為迅速，甚至出現骨及其他組織器官轉移，嚴重者可導致死亡[8-10]。因此，應尋找前列腺癌有效生物分子標志，為臨床診斷和治療前列腺癌提供新思路[11-13]。

COX是花生四烯酸生物合成前列腺素過程中重要的一種限速酶，有3種亞型，包括COX-1、COX-2和COX-3，其中COX-2在大多數細胞中少量表達或不表達，當細胞受促癌劑、促炎細胞因子等刺激時，COX-2表達升高，且參與腫瘤、炎癥的形成和發展[14]。COX-2可通過抑制免疫功能、促進血管形成、抑制細胞凋亡及促進細胞增殖等機制，參與腫瘤的發生、發展[15]。近年來研究報道顯示，COX-2在許多惡性腫瘤及癌前病變中均呈高表達，如乳腺癌、淋巴瘤、結直腸癌等，且其表達與惡性程度、分期及預后密切相關[16]。臨床研究報道顯示，COX-2在前列腺癌中高表達，能夠促進前列腺癌細胞增殖，抑制前列腺癌細胞凋亡，以及促進前列腺癌的轉移浸潤[17]。本研究表明，觀察組COX-2陽性率高于對照組，COX-2 mRNA相對表達量高于對照組，COX-2蛋白表達灰度值高于對照組，提示前列腺癌組織中COX-2高表達。Ki-67是反映細胞增殖的一種核抗原，主要位于細胞核，其半衰期較短。Ki-67作為一種與細胞分裂關系緊密的核蛋白，其在多種惡性腫瘤中表達[18-19]。研究報道顯示，Ki-67在胃癌、乳腺癌、宮頸癌組織中表達高于正常組織[20]。本文研究報道顯示，前列腺癌組織中Ki-67表達高于癌旁組織，說明前列腺癌組織中Ki-67呈高表達。本研究結果表明，觀察組Ki-67陽性率高于對照組，Ki-67 mRNA相對表達量高于對照組，Ki-67蛋白表達灰度值高于對照組，提示前列腺癌組織中Ki-67高表達。

此外，本研究分析了COX-2和Ki-67與前列腺癌病理特征間的關系，從表5可以看出，COX-2及Ki-67表達陽性均與臨床T分期、淋巴結轉移及PSA水平密切相關。梅傲冰等[21]的研究證實，PSA水平與前列腺癌臨床分期和淋巴轉移呈正相關。PSA是目前前列腺癌診斷最為敏感的生物指標之一，由此推測COX-2、Ki-67蛋白表達水平均與PSA水平存在關聯。本文研究不足在于納入研究樣本量相對較少，缺乏多中心、多樣本深入研究，因此，還需在后續研究中增加樣本量和觀察指標作多中心、多樣本深入研究。

4 結 論

COX-2和Ki-67過表達與前列腺癌的發生有關，可能是前列腺癌的發病機制之一，且二者可成為前列腺癌的診斷標志物和潛在治療靶點。