雙黃連聯合抗菌藥物對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌體外抑菌的研究*

馬冬梅，陶慶春，蔣東葵，張一瑤

(北京中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，北京 100029)

肺炎克雷伯菌是目前臨床感染常見的病原菌之一。近幾年肺炎克雷伯菌耐藥菌株檢出呈上升趨勢[1-4]，耐藥菌株的抗感染治療給臨床帶來極大困難。本次試驗采用肉湯稀釋法測定雙黃連、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、米諾環素單獨應用的最低抑菌濃度(MIC)及3種抗菌藥物與雙黃連聯合應用對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌株的MIC，并分別計算聯合用藥部分抑菌濃度(FIC)指數，比較雙黃連與抗菌藥物的聯合抑菌效果，為臨床抗感染治療提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 標本均來自本院臨床患者，采集日期為2016年1月17日至2018年2月18日。經Phoenix100全自動微生物鑒定儀鑒定菌株，參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)M100-S27標準判讀藥敏結果，分離出廣泛耐藥肺炎克雷伯菌30株，質控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2培養基 試驗用血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、M-H肉湯培養基、M-H瓊脂培養基，所需培養基均由OXOID公司生產。

1.3試驗藥物 雙黃連粉針劑(1.2 g/瓶，批號：1508110，哈藥集團中藥二廠)、亞胺培南西司他丁鈉(亞胺培南500 mg：西司他丁鈉500 mg，批號：M029976，杭州默沙東制藥有限公司)、頭孢哌酮/舒巴坦(頭孢哌酮1.0 g：舒巴坦0.5 g，批號：1539364，美國輝瑞制藥有限公司)、鹽酸米諾環素(100 mg/?！?0，批號：M33252，惠氏制藥有限公司)。

1.4儀器設備 賽多利斯電子分析天平、全自動微生物鑒定藥敏分析儀(BD公司，Phoenix100)、麥氏比濁儀、微量加樣器、試管若干。

1.5試驗方法

1.5.1試驗菌液配制 將30株廣泛耐藥肺炎克雷伯菌試驗菌株分純培養，取純培養菌落，配置成0.5麥氏比濁，再進行10倍稀釋備用。

1.5.2MIC測定 取雙黃連粉針劑1瓶(1.2 g)溶于3 mL生理鹽水，配制成400 mg/mL的原始濃度藥液，進行對倍稀釋成7個濃度梯度。再分別取亞胺培南西司他丁鈉1瓶(亞胺培南500 mg)溶于5 mL生理鹽水配制亞胺培南藥物儲備液100 mg/mL。頭孢哌酮/舒巴坦1瓶(1.5 g)溶于15 mL生理鹽水配制頭孢哌酮/舒巴坦藥物儲備液100 mg/mL。鹽酸米諾環素1粒(100 mg)溶于10 mL生理鹽水配制米諾環素藥物儲備液10 mg/mL，再分別用微量加樣器吸取3種藥物儲備液，將亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素稀釋成試驗濃度1 024、1 024、128 μg/mL，然后各組藥液進行對倍稀釋成7個濃度梯度。按此系列濃度共配制30組藥液，取配制好的藥液加入無菌試管1 mL，再于各組試管中加入50 μL試驗菌液，35 ℃培養24 h，測定雙黃連、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素對30株菌的MIC值。

1.5.3聯合抑菌試驗 根據30株菌對雙黃連、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素的MIC結果，以每種藥物MIC值的2倍為最高濃度，倍比稀釋成8個濃度。采用棋盤法設計，分別將雙黃連和3種抗菌藥物兩兩混合，每種藥液各加0.5 mL，再于每管加入50 μL菌液，35 ℃培養24 h，記錄最佳組合效應時的MIC值，分別計算雙黃連分別聯合3種抗菌藥物對30株廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的FIC指數。

1.5.4結果判讀 FIC指數=甲藥聯合的MIC/甲藥單用的MIC+乙藥聯合的MIC/乙藥單用的MIC。FIC指數≤0.5表示協同作用，FIC指數>0.5～1.0表示相加作用，FIC指數>1.0～2.0表示無關作用，FIC指數>2.0表示拮抗作用。

2 結 果

2.1藥物單用及聯合應用MIC結果 雙黃連、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素單用及聯合應用MIC值、MIC值范圍見表1～4。從表2～4可以看出，雙黃連與亞胺培南聯合用藥以后，MIC值范圍比單獨用藥有所降低；雙黃連與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥以后，MIC值范圍與單獨用藥沒有變化，雙黃連與米諾環素聯合用藥以后，MIC值范圍相比反而升高。

2.2濃度-累積抑菌百分率曲線 雙黃連、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素單用和聯合應用濃度-累積抑菌百分率曲線見圖1、2。由圖1、2可知，雙黃連和頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合應用與單用相比，濃度-累積抑菌百分率曲線在一定范圍內右移，說明雙黃連和頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合應用比單用其MIC值在一定范圍內有所升高；雙黃連與亞胺培南聯合應用與單用相比，曲線明顯左移，表明雙黃連與亞胺培南聯合用藥可降低各自的MIC值。

表1 單用以及聯用對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的MIC值

注：*表示兩種藥物MIC值單位分別是mg/mL和μg/mL。

表2 雙黃連、亞胺培南單用及雙黃連聯合亞胺培南MIC值

表3 雙黃連、頭孢哌酮/舒巴坦單用及雙黃連聯合頭孢哌酮/舒巴坦MIC值

表4 雙黃連、米諾環素單用及雙黃連聯合米諾環素MIC值

2.3FIC指數分布 藥物聯合應用對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌FIC指數分布見表5。雙黃連和亞胺培南聯合應用FIC指數結果顯示：FIC指數≤0.5占6.7%，FIC指數>0.5～1.0占53.3%，FIC指數>1.0～2.0占33.3%，FIC指數>2.0占6.7%。雙黃連和頭孢哌酮/舒巴坦聯合應用的FIC指數結果顯示：FIC指數≤0.5占0，FIC指數>0.5～1.0占13.3%，FIC指數>1.0～2.0占23.3%，FIC指數>2.0占63.3%。雙黃連和米諾環素聯合應用的FIC指數結果顯示：FIC指數≤0.5占0，FIC指數>0.5～1.0占3.3%，FIC指數>1.0～2.0占30.0%，FIC指數>2.0占66.7%。

圖1 雙黃連單用及與亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合應用濃度-累積抑菌百分率曲線

圖2 亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素單用及與雙黃連聯合應用濃度-累積抑菌百分率曲線

表5 雙黃連與亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合應用FIC指數分布[n(%)]

3 討 論

廣泛耐藥肺炎克雷伯菌給臨床治療帶來很大挑戰，專家共識指出耐藥革蘭陰性菌應選用抗菌藥物聯合治療方案[5]，目前清熱解毒類中藥已經被臨床廣泛應用，其抗菌效果也越來越受到關注[6-9]。

雙黃連粉針劑是臨床常用的中成藥，具有清熱解毒、輕宣透邪的功效，并且相關研究表明其具有一定抑菌抗炎作用[10-13]。本次試驗從雙黃連與亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素單用及聯合應用MIC分布范圍、濃度-累積抑菌百分率曲線及兩藥聯合應用FIC指數綜合分析。結果表明雙黃連和亞胺培南聯合應用能在一定范圍內降低各自的MIC值，30株菌兩藥聯合應用協同作用占6.7%，相加作用占53.3%，聯合應用抑菌效果較好。雙黃連和頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合應用后，對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌無協同作用、相加作用僅占13.3%和3.3%，聯合抑菌作用較差。雙黃連與亞胺培南聯合應用明顯優于與頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環素聯合應用的抑菌效果。中藥聯合抗菌藥物抑菌機制尚不明確，可能與改變細菌細胞壁、細胞膜通透性、抑制生物被膜形成、改變細菌外排等原因有關[14-16]，具體機制仍需研究。由于本次研究為體外抑菌試驗，體外和體內環境不同，不同患者感染病原菌數量不同，藥物聯合應用對于體內療效如何及是否有藥物配伍不良反應也有待進一步臨床研究。

4 結 論

雙黃連聯合亞胺培南對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌多數表現為協同作用和相加作用，體外聯合抑菌作用較好；而雙黃連分別與頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素聯合多數表現為無關作用和拮抗作用，對廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的體外聯合抑菌作用較差。