淋巴細胞VCS參數輔助診斷活動性肺結核的臨床應用研究*

張峰領,袁 濤,王 靜,孫婷婷,鄧少麗△

(陸軍軍醫大學大坪醫院：1.檢驗科；2.肝膽外科，重慶 400042;3.重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科，重慶 400036)

結核病是結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病。據世界衛生組織統計，2017年大約有1 000萬例新發結核病，157萬結核病患者死亡。而人群中1/3均為結核桿菌感染者，其中5%～10%會發展為活動性結核[1-3]，我國是排在印度之后的第二大結核病高負擔國，面臨的結核病防控形勢非常嚴峻，缺乏有效的診斷方法是困擾結核防控的重要原因。現有的結核相關實驗室檢查如抗酸染色法、分離培養法是實驗室診斷金標準，但存在著陽性率低、檢測時間長等缺陷，結核菌素試驗假陽性、假陰性都較高，γ干擾素釋放試驗對結核桿菌感染具有較高的靈敏度和特異度，但不能區分潛伏性結核和活動性肺結核[3-6]，因此，臨床上迫切需要輔助診斷活動性肺結核的新指標。血液分析儀的VCS技術通過檢測細胞體積(Volume)、導電率(Conductivity)、多個角度的光散射(Scatter)，能準確、快速地對8 000個白細胞的形態做全面評價[7-10]。有研究發現[11-13]，在病毒性感染性疾病及淋巴細胞相關白血病中，淋巴細胞VCS參數可發生明顯改變，目前筆者查閱文獻尚未見淋巴細胞VCS參數在結核診斷中的研究。本研究分析淋巴細胞VCS參數的變化，以評估其在活動性肺結核診斷中的應用，包括高中角度光散射(UMALS)、中角度光散射(MALS)、低中角度光散射(LMALS)、低角度光散射(LALS)檢測細胞顆粒度和膜形貌軸向光損耗測量(AL2)，分析細胞透明度。同時獲得與細胞形態直接相關的3個形態參數對白細胞進行檢測分析。在三維空間里，對細胞體積、大小、顆粒度多少進行全方位檢測獲得一系列參數，準確、快速地對白細胞內部、外部形態進行全面評價[14]。機體受到結核分枝桿菌感染后，淋巴細胞會被激活并釋放細胞因子抑制結核分枝桿菌[15]，其細胞體積大小及導電率也會發生相應的變化。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年7月至2018年6月重慶市公共衛生醫療救治中心及陸軍軍醫大學大坪醫院活動性肺結核患者97例，潛伏性結核113例，體檢健康者101例(健康對照組)，對其淋巴細胞VCS參數進行檢測。根據中華人民共和國衛生行業肺結核診斷標準(WS 288—2017)，活動性肺結核患者納入標準：痰培養、痰抗酸染色、分子診斷至少有1個陽性[15]，胸部X線片表現符合結核病影像學病變，所選病例均無抗結核藥物治療史。潛伏性結核患者納入標準：γ-干擾素釋放試驗陽性，痰涂片和結核分枝桿菌培養均陰性，無結核病的相關臨床癥狀[16]。健康對照納入標準：無結核患者接觸史，胸部X線片表現正常，結核感染T細胞斑點檢測(T-SPOT.TB)實驗陰性，肝功、腎功、乙型肝炎、血常規檢查均正常。排除標準：年齡<18歲、孕婦、HIV病毒感染、癌癥、自身免疫性疾病患者，正在接受免疫抑制劑或已接受抗結核治療者均不入選。

1.2儀器與試劑 UniCel Coulter DxH800全自動血液分析儀及原裝配套試劑和質控品(美國Beckmanculter公司)；T-SPOT.TB 試劑盒(英國Oxford Immunotec公司)；RPM1640 細胞培養液(中國天津灝洋生物制品科技有限公司)；人全血淋巴細胞分離液和AIM-V?Medium CTS?(AIM-V)培養液(中國天津太平洋生物科技股份有限公司)。所用實驗耗材均需高壓滅菌、干燥后才使用。

1.3方法

1.3.1VCS參數分析 各研究對象均抽取外周靜脈血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管，立即顛倒混勻，所有樣本在采集后4 h內完成檢測，使用UniCel Coulter DxH800血液分析儀配套試劑和質控品，標本無凝血及溶血。檢測項目包括白細胞計數(WBC)、淋巴細胞百分比(LY%)、淋巴細胞VCS參數。VCS參數包括淋巴細胞平均體積(MLV)、淋巴細胞平均體積標準差(MLV-SD)、淋巴細胞平均導電率(MLC)、淋巴細胞平均導電率標準差(MLC-SD)、UMALS、UMALS標準差(UMALS-SD)、MALS、MALS標準差(MALS-SD)、LMALS、LMALS標準差(LMALS-SD)、LALS、LALS標準差(LALS-SD)、AL2、AL2標準差(AL2-SD)。

1.3.2T-SPOT.TB 實驗和結果判讀 各研究對象使用肝素鈉真空采血管抽取4～8 mL外周靜脈全血，按照試劑說明書，每份標本設置2個檢測孔和2個質控對照孔，分別為特異性抗原A檢測孔(加入ESAT-6溶液50 μL)、特異性抗原B檢測孔(加入CFP-10溶液50 μL)、陽性質控對照孔(加入PHA 50 μL)、空白對照孔(加入AIM-V 50 μL)，每孔加入按照說明書配置的標準細胞液100 μL。加樣后將培養板放在37 ℃含%CO2培養箱孵育16～20 h。用200 μL新鮮準備的無菌PBS洗板4次。拍干后每孔加入酶標抗體50 μL(1∶200倍稀釋)，置2～8 ℃冰箱孵育1 h。取出后再次PBS洗板，拍干后每孔加入顯色液50 μL，室溫避光反應7 min，以蒸餾水終止反應。置于37 ℃，5% CO2孵箱2～3 h或室溫過夜干燥培養板，使用顯微鏡、放大鏡或自動計數儀檢測孔內結合在底膜上的特異性斑點數(清晰的紫色斑點、中間色深、周圍有淺色暈的點)。結果判讀：(1)判讀為“有反應性”(陽性)，見于①空白對照孔斑點計數為0～5個時且抗原A(或B)孔的斑點數減去空白對照孔的斑點數后，數值≥6；②空白對照孔斑點數為6～10個時且抗原A(或B)孔的斑點數≥2倍空白對照孔斑點數。(2)判讀為“無反應性”(陰性)，見于不符合(1)的標準且陽性質控對照孔正常時檢測結果為“無反應性”。

2 結 果

2.1肺結核患者中淋巴細胞VCS參數的變化 活動性肺結核組97例，年齡21～80歲，平均(49.800±14.500)歲，男性53例，女性44例；潛伏性結核組113例，年齡21～77歲，平均(50.200±17.700)歲，男性48例，女性65例；健康對照組101例，年齡19～82歲，平均(15.900±19.100)歲，男性51例，女性50例。3組在年齡、性別上差異無統計學意義(P>0.05)。

淋巴細胞VCS參數的MLV、MLV-SD、MLC-SD、MALS-SD、UMALS-SD、LMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD及LALS在活動性肺結核組顯著高于潛伏性結核組和健康對照組(P<0.05)，但MALS、LMALS在活動性肺結核組明顯低于潛伏性結核組和健康對照組(P<0.05)，淋巴細胞VCS參數的所有指標在潛伏性結核組與健康對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2淋巴細胞VCS參數診斷活動性肺結核的靈敏度與特異度 根據約登指數選擇最佳臨界值，即ROC曲線上所有點的靈敏度和1-特異度之間差異最大時所取數值。進行多指標聯合診斷時，有任何一項為陽性即可判斷為陽性結果。通過對淋巴細胞VCS參數區分活動性肺結核與潛伏性結核感染的靈敏度與特異度分析，MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD獲得比其他參數更高的曲線下面積，分別為0.775、0.900、0.802、0.860、0.785，見表2。同時測量MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD可獲得曲線下面積高達0.920，并且其區分活動性肺結核與潛伏性結核感染的靈敏度和特異度分別為79.40%和92.90%。見表2、圖1。

表1 3組淋巴細胞VCS參數的變化

注：P1表示活動性肺結核組與潛伏性結核組比較；P2表示活動性肺結核組與健康對照組比較。

表2 淋巴細胞VCS參數診斷活動性肺結核的靈敏度和特異度

注：-表示無數據。

圖1 淋巴細胞VCS參數ROC曲線

3 討 論

結核病位列傳染病死因第1位，缺乏有效的診斷方法是其重要原因之一。γ干擾素釋放實驗可有效診斷結核感染，但不能有效區分活動性肺結核與潛伏性結核。人體受到結核分枝桿菌感染后會啟動巨噬細胞和致敏的淋巴細胞參與免疫反應，激活的T淋巴細胞釋放出γ干擾素、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素12等細胞因子抑制結核桿菌的生長[17]，淋巴細胞形態在抗結核免疫過程中發生明顯的改變。本研究通過DxH800血液分析儀的VCS技術直接對活動性肺結核患者外周血中淋巴細胞的形態特征進行檢測，結果證實活動性肺結核組中MLV、MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD顯著高于潛伏性結核組和健康對照組。這些變化提示結核感染后，激活的淋巴細胞體積增大，體積異質性增加。細胞核/細胞質比例偏高(核幼稚程度更高)，部分淋巴細胞參與抗結核免疫反應，細胞質內顆粒增多，膜形態等發生顯著改變，這與本研究結果相吻合，細胞受到結核分枝桿菌感染后，MLV及MLV-SD與潛伏性結核感染相比，明顯增大。MLC雖然沒有變化，但其MLC-SD已經提示細胞存在異質性，由于受感染細胞被激活，分泌各種細胞因子，細胞質內顆粒增多，從而導致細胞各角度的光散射不同程度地在活動性肺結核組與潛伏性結核組、健康對照組間有顯著的差異，其異質性如UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD明顯增加。并且通過ROC曲線分析顯示，MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD 的曲線下面積均達0.800以上，同時測量這5個參數，獲得曲線下面積高達0.920，靈敏度為79.40%，特異度為92.90%，可以作為潛在的參考指標用于輔助診斷活動性肺結核，且該指標可用于區分活動性肺結核與潛伏性結核。

研究提示，在膿毒血癥、菌血癥等細菌性感染中，中性粒細胞VCS參數發生顯著變化[18-20]，結核感染主要通過激活巨噬細胞和淋巴細胞發揮抗結核免疫作用，本研究結果提示淋巴細胞參與抗結核免疫，其細胞體積及內部結構、所含顆粒均在結核病患者與健康人群中差異顯著，淋巴細胞VCS參數可區分活動性肺結核和潛伏性結核感染，對臨床診斷不同感染狀態的結核有重要意義。

本研究受到樣本量小和選擇范圍很大的限制，這些限制可能導致摻入偏差過高估計所研究參數的診斷能力。因此，需要更大規模的前瞻性隊列研究來進一步驗證VCS參數。

4 結 論

淋巴細胞形態學參數通過血常規分析儀很容易獲得，檢測成本低，并且這些參數能快速、準確、客觀地反映細胞的內在生物學特征，有潛在的臨床應用價值。特別是在γ干擾素釋放實驗陽性結果的基礎上，聯合淋巴細胞VCS參數分析，為臨床輔助診斷活動性肺結核提供有意義的參考。