2014—2018年仙桃市傷寒沙門菌分子分型及耐藥性分析*

葉恒平，張雅婷，袁 敏，邢學森，呂 靜，何 飛，周海健，李國明，楊紅梅△

(1.仙桃市疾病預防控制中心，湖北仙桃 433000；2.湖北省疾病預防控制中心，湖北武漢 430079；3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 100026)

傷寒沙門菌引起的傷寒是常見的消化道傳染病，目前仍是重要的公共衛生問題[1]，主要通過糞-口傳播。食用受污染的水產品，飲用未煮沸的水或消毒不徹底的牛奶，生食瓜果蔬菜等均有可能導致該菌的傳播，人口流動、個人衛生習慣、地方飲食風俗、環境衛生、食品衛生、水源管理、糞便管理、經濟條件及居住環境等對傷寒沙門菌流行起著重要的作用，由于慢性帶菌者持續存在，傳播途徑不易徹底切斷[2]。仙桃市是湖北省的傷寒高發區，每年發病率在全省排名位列前3位。2013年仙桃市某高校出現了傷寒暴發，暴發后在學校及周邊部分區域開展重點人群傷寒Vi多糖疫苗應急接種，但由于傷寒沙門菌莢膜多糖(Vi抗原)疫苗人工免疫效果欠佳，散發病例在仙桃市仍時有出現。為了解仙桃市傷寒沙門菌耐藥性和分子分型特征，本研究通過對2014—2018年仙桃市腸道門診監測系統收集并分離的傷寒沙門菌進行藥敏試驗、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型及多位點序列分型(MLST)研究，對該地區的傷寒防控有重要意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株來源于2014—2018年仙桃市傷寒患者血液或糞便樣本中分離的29株傷寒沙門菌。藥敏質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和PFGE的分子質量標準參考菌株H9812均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 CHEF MAPPER PFGE儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，VitekⅡ全自動生化分析儀(法國梅里埃公司)，Vitek比濁儀(法國梅里埃公司)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，隔水式恒溫培養箱(上海齊欣)，去離子水系統(美國Milipore公司)，APLUS震蕩恒溫水槽(美國APLUS實驗室通用儀器公司)，DK-8D電熱恒溫水槽(上海齊欣儀器公司)，TU-100C恒溫金屬浴(上海一恒儀器公司)，5424R 臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，AIM自動接種系統(美國Thermo Fisher公司)。

1.2.2試劑 沙門顯色培養基(中國科瑪嘉公司)，VITEK革蘭陰性細菌鑒定卡(法國梅里埃公司)，沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司)，革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(美國Thermo Fisher公司，型號CHN1GOV、CHN2GOV)，Xba Ⅰ酶、100 bp DNA Ladder[寶生物工程(大連)有限公司]，SeaKemGold Agarose瓊脂糖(美國Cambrex公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，十二烷基肌氨酸鈉(美國Sigma公司)，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、5×TBE(北京索萊寶科技有限公司)。所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1菌株復核 將菌株復蘇后接種至沙門顯色培養基上，37 ℃培養過夜。挑取單個紫色菌落按照Vitek革蘭陰性細菌鑒定卡使用說明書進行生化實驗。生化復核后，進行玻片凝集試驗[3]。

1.3.2PFGE分型 參考文獻[4-6]，選用XbaⅠ限制性內切酶對實驗菌株和H9812進行酶切(37 ℃，3 h)。電泳參數：初始脈沖2.16 s，最終脈沖63.8 s，電壓6 V/cm，電場夾角120°，電泳溫度14 ℃，電泳時間19 h。電泳結束后，進行染色、脫色，再采用凝膠成像系統獲取圖像。PFGE圖像導入Bio Numerics 7.6軟件，設置Dice相關系數為1.5%，選擇非加權組平均法(UPGMA)，設置條帶位置差異容許度為1.5%，進行聚類分析。分型判別標準參考文獻[7]，相似度100%認定為同一PFGE帶型。

1.3.3MLST分析 挑取傷寒沙門菌單個菌落接種營養肉湯，37 ℃生長過夜后取1.5 mL菌液8 000 r/min離心10 min，去上清后沉淀復懸于1.0 mL無菌超純水中，100 ℃金屬浴10 min，13 200 r/min離心10 min，留取上清液作為PCR模板。利用擴增引物及條件(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min)分別擴增7個管家基因片段(thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN)后進行測序[8]。管家基因位點選擇參見愛爾蘭科克大學(University College Cork,Ireland)MLST網站(http://mlst.ucc.ie)，擴增及測序引物參見http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica/documents/primersEnterica_html。

1.3.4藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法對最低抑菌濃度(MIC值)進行測定。將傷寒沙門菌轉種腦心浸液瓊脂平板，37 ℃培養16 h后混懸于0.85%生理鹽水中制成0.5麥氏單位懸液，采用自動接種系統接種至藥敏檢測微孔板中，藥物包含氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環素、氯霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺異噁唑、環丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、多黏菌素E、多黏菌素B、米諾環素、阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、卡那霉素、鏈霉素，同時大腸埃希菌ATCC 25922作為質控菌株。依據藥敏檢測板說明書進行操作，36 ℃孵育培養，18 h后系統依據微孔板中菌株生長與否判讀MIC值。結果的判定依據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2019年出版的M100藥敏試驗指南進行[9]。

1.3.5產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)耐藥基因檢測 采用煮沸法提取菌株及質粒DNA。PCR擴增反應體系為25.0 μL，包含12.5 μL 2×PCR反應混合物，純水9.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 40 s、52 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，35個循環；75 ℃延伸5 min。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10型基因引物序列及反應條件見表1[10-11]，引物序列合成及PCR擴增產物測序由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成。測序結果進行GenBank Blast比對。

表1 ESBLs耐藥基因PCR引物及序列

圖1 傷寒沙門菌PFGE圖譜和相關信息

2 結 果

2.1菌株復核結果 29株菌經生化及血清復核后均為傷寒沙門菌。其中27份菌株來源于患者血液，2份菌株來源于患者糞便。29株菌中2014年5株，2015年2株，2017年14株，2018年8株。病例年齡10～79歲，其中11～20歲占27.6%(8/29)，其次為21～30歲及41～50歲，均占17.2%(5/29)，其他年齡組分布依次為31～40歲占13.8%(4/29)，51～60占10.34%(3/29)，61～70歲占6.9%(2/29)，70歲以上占6.9%(2/29)。男、女性別比為0.61:1(11/18)，以女性為主。見圖1。

2.2分子分型結果 29株傷寒沙門菌經Xba Ⅰ酶切PFGE電泳后，根據電泳條帶的不同，29株傷寒沙門菌可分為6個型別(HuBXTSal001～HuBXTSal006)，其中HuBXTSal003型包含24株菌，為優勢帶型。其余5種帶型分別只包含1株菌。HuBXTSal004、HuBXTSal005、HuBXTSal006與HuBXTSal003相比分別只有4條帶的差異。將這24株HuBXTSal003型圖譜與仙桃市疾病預防控制中心所保存的2013年仙桃傷寒暴發疫情[12]中所分離到的菌株PFGE圖譜進行比對，發現這24株菌與2013年暴發菌株帶型一致，均為HuBXTSal003帶型。29株傷寒沙門菌MLST分型分為2個ST型。27株血液分離菌株為ST2型(等位基因譜為1-1-2-1-1-1-5)；2株糞便來源菌株為ST19型(等位基因譜為10-7-12-9-5-9-2)。見圖1。對患者來源地點進行分析，可以發現，患者主要來自于干河街道(8例，27.5%)、龍華山街道(5例，17.2%)及沙嘴街道(5例，17.2%)，在空間上較為集中。

2.3藥敏試驗結果 29株傷寒沙門菌中分離自血液的27株菌對26種抗菌藥物均為敏感/中度敏感；分離自糞便的有2株菌對抗菌藥物有不同程度的耐藥性，見表2。分離自糞便的有2株菌株，菌株號為HB-2015-SAL-02的菌株對氨芐西林及四環素耐藥，菌株號為HB-2014-SAL-01的菌株耐藥譜分布較廣，耐藥藥物名稱為AMP-A/S2-TET-CHL-STX-FAZ-FOT-TAZ-FOX-AZI- FIS-CIP-AUG-MIN-AZT-KAN-STR。將這2種耐藥菌株送至國家疾病預防控制中心采用紙片擴散法進一步確認，結果均一致。與分離自血液的菌株耐藥結果相比，糞便來源的菌株耐藥譜分布較廣，且出現了1株多重耐藥菌株。

表2 29株傷寒沙門菌抗菌藥物耐藥情況[n(%)]

續表2 29株傷寒沙門菌抗菌藥物耐藥情況[n(%)]

2.4ESBLs細菌耐藥基因檢測 選取對氨芐西林和β-內酰胺酶抑制劑均耐藥的菌株HB-2014-SAL-01,對其進行blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10 9種ESBLs基因檢測，電泳結果見圖2，僅有blaOXA-1擴增產物符合目的產物大小，經測序驗證為blaOXA-1。

注：泳道1為分子標志物，泳道2～10依次為blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10擴增產物，泳道11為陰性對照。

圖2 耐藥基因檢測電泳結果

3 討 論

2010—2015年全國傷寒發病率約為0.65/10萬[13-14]，湖北省不屬于傷寒高發區域，仙桃地區除2013年仙桃市某學校暴發傷寒疫情至今，發病率也基本控制在0.01/10萬至0.93/10萬，處于相對平穩且無暴發流行的狀態，流行趨勢以高度散發為主[12]。本研究中傷寒病例年齡在10～79歲，男、女性別比為0.61∶1，發病時間集中于夏秋季，體現了仙桃市近年來傷寒流行病學的基本特點和變化趨勢。對仙桃市傷寒沙門菌流行菌株開展藥敏監測和分子分型分析，可指導臨床用藥和特殊人群的預防性服藥，在疫情防控中確定病原菌特征、分析傳播途徑、追溯傳染源、研究菌株之間的親緣性等方面具有重要作用。

PFGE是大多數細菌病原體分子分型的金標準，選用全基因組DNA在統一設定識別罕見切點的內切酶和實驗條件下，以不同相對分子質量的差異作為分離不同分子的依據。PFGE因費用較低、結果直觀，因而應用較廣。其中HuBXTSal003型菌株出現在同一地區(仙桃市干河街道6株)不同的時間(4株為2017年菌株，1株為2018年菌株，1株為2014年菌株)，在不同年份(2014年4株，2015年1株，2017年12株，2018年7株)反復出現反應傷寒沙門菌不斷變異中的一種相對的穩定型，提示當地污染源持續存在，可能存在慢性帶菌者群體，特別是2017年的12株與2018年的7株HuBXTSal003型簇聚類可能存在相同來源暴露的傷寒沙門菌潛在暴發。由于本研究菌株來源于腸道門診監測系統，均為傷寒患者標本分離所得，因此，未能在環境中揭示出暴露來源，還需結合流行病進一步開展聚集性傷寒病例的溯源工作，找出可能持續存在的感染源頭。

MLST因其易標準化而被廣泛用于不同地區不同菌株的比較和生物進化研究。MLST分型結果顯示，29株傷寒沙門菌分為ST2(27株)和ST19(2株)兩個序列型別，表明仙桃市傷寒沙門菌株存在優勢克隆。官網(http://mlst.ucc.ie)查詢表明，這2種型別傷寒沙門菌在各地均廣泛分布。

仙桃市的傷寒沙門菌耐藥情況與其他地區不盡相同[15-17]，分離自血液的27株菌對喹諾酮類的敏感率高達100%，提示環丙沙星可作為成人臨床治療傷寒沙門菌感染的首選藥物。同時，這27株菌對第3、4代頭孢菌素類抗菌藥物均為敏感，但頭孢菌素類抗菌藥物易引起ESBLs、Ampc酶等一系列多重耐藥菌的產生。隨著臨床中抗菌藥物的廣泛應用，傷寒沙門菌對抗菌藥物的敏感性逐漸降低，多重耐藥菌株顯著增多[18]，故應慎重選擇并加強耐藥監測。

本研究還顯示分離自糞便的菌株耐藥譜分布較廣。本研究采用的藥敏試驗為微量肉湯稀釋法進行MIC測定，發現1株耐藥菌株對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、四環素類、β-內酰胺/β-內酰胺抑制劑復合物、單環內酰胺類等抗菌藥物耐藥。但對該菌進行ESBLs耐藥基因檢測發現為blaOXA-1，也從分子層面驗證了該菌株對β-內酰胺/β-內酰胺抑制劑復合物類藥物耐藥。在本研究發現的此多耐藥菌株來自較大年齡患者(63歲)，對3代頭孢菌素已產生了耐藥，僅對碳青霉烯類抗菌藥物敏感，有基礎疾病且住院時間較長，存在院內獲得性耐藥可能，也有可能是傷寒沙門菌和患者腸道內的某些攜帶耐藥基因的菌株進行了基因交換獲得，尚需進一步實驗闡明。遺憾的是本研究耐藥病例較少，但隨著研究病例的增多，將對科學合理用藥提供更為有力的依據。

4 結 論

2014—2018年仙桃市所分離的傷寒沙門菌株存在優勢PFGE帶型及優勢ST型，與血液來源的菌株不同，分離自糞便的菌株耐藥譜分布較廣，并出現了多重耐藥菌株。因此，需加強該地區的病例監測，并開展傷寒病例的溯源工作，發現并控制危險因素。