慢性丙型肝炎患者抗核抗體譜的表達及臨床意義*

賀琤雯，薛 苗，姚文杰，魯 瓊

(海軍軍醫大學附屬長海醫院實驗診斷科，上海 200433)

丙型肝炎病毒(HCV)是一種嗜肝RNA病毒。慢性HCV感染可導致肝細胞自身免疫性抗原表位暴露而誘發自身免疫系統疾病。自首次在自身免疫性肝炎患者血清中檢出HCV特異性抗體以來，HCV感染與自身免疫的關系越來越受到臨床關注[1]。同時，長期存在的自身免疫功能紊亂可能是誘發肝細胞惡變的原因之一。有文獻報道，70%以上HCV感染者可出現自身抗體，包括抗核抗體(ANA)、胰島素相關抗體、甲狀腺過氧化物酶抗體等[2-3]。然而，HCV感染者抗核抗體譜(LIA-ANAs)的表達鮮有報道。本研究通過回顧性分析臨床確診的慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs的分布及其與性別、年齡、HCV-RNA載量、肝臟功能等的關系，旨在探討慢性丙型肝炎患者出現自身抗體的臨床意義，為進一步診斷、治療及預后判斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據臨床診療結果及實驗室檢測指標進行回顧性分析。選取2018年3—7月海軍軍醫大學附屬長海醫院感染科門診和住院收治的慢性丙型肝炎患者血清標本81例作為慢性丙型肝炎組，其中男性48例(59.3%)，女性33例(40.7%)；年齡24～86歲，平均(51.4±10.6)歲。同時選取81例體檢健康者作為健康對照組，其中男性45例(55.6%)，女性36例(44.4%)；年齡24～86歲，平均(52.1±11.3)歲。2組在性別、年齡上差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2病例納入、排除標準 所有慢性丙型肝炎病例的臨床診斷均符合中華醫學會肝病學分會、中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會2015版《丙型肝炎防治指南》的相關標準[4]，即HCV感染超過6個月，或有6個月以前的流行病學史；HCV抗體(抗-HCV)及HCV-RNA陽性，肝臟病理學檢查符合慢性肝炎。排除其他病毒性肝炎、藥物性肝炎及自身免疫性疾病。

1.3儀器與試劑 北京科美生物技術有限公司提供的CHEMCLIN 1500全自動化學發光儀、EUROStar Ⅱ熒光顯微鏡、EUROBlotMaster 44半自動免疫印跡儀、EUROLINEScan掃描儀、日立7600型全自動生化分析儀、羅氏Cobas 4800熒光定量PCR儀。化學發光法檢測試劑采用北京科美生物技術有限公司HCV-IgG化學發光免疫檢測試劑盒(試劑盒批號：20180428)。間接免疫熒光法檢測試劑采用歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司生產的ANA間接免疫熒光試劑盒(試劑盒批號：CF180506AB)。免疫印跡法檢測試劑采用歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司生產的LIA-ANAs試劑盒(試劑盒批號：D180503AA)。生化指標檢測采用上海科華生物工程公司生產的相應試劑盒。HCV-RNA定量檢測采用上海科華生物有限公司提供的HCV-RNA熒光定量PCR檢測試劑盒(試劑盒批號：18022511)。

1.4方法

1.4.1樣本采集與保存 符合上述標準的人群采用真空采血管按常規采血步驟采清晨空腹靜脈血3 mL，1 h內以3 000 r/min離心分離血清并檢測。未能及時檢測的樣本分離血清后-20 ℃保存，7 d內檢測完畢。

1.4.2HCV-IgG檢測 采用北京科美生物技術有限公司HCV-IgG化學發光免疫檢測試劑盒，操作完全按照試劑和儀器說明書進行，信號/陰性對照比值(S/Co)≥1為陽性。HCV-IgG質控品由上海市臨床檢驗中心提供，HCV-IgG化學發光法室內質控批號：1801、1802。

1.4.3免疫印跡法檢測LIA-ANAs 該試劑膜條可同時檢測以下15種自身抗體：nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、著絲點蛋白B(CENP B)、增殖細胞核抗原(PCNA)、雙鏈DNA(ds-DNA)、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白(rRNP)、線粒體-M2(AMA-M2)的抗體。其中CENP B、PM-Scl、Ro-52、PCNA為重組抗原，其余均為經親和層析純化的天然抗原。待檢血清1∶100倍稀釋后進行檢測，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。靶抗原部位出現棕色條帶，即為該自身抗體陽性。

1.4.4ANA檢測 采用德國歐蒙公司提供的ANA間接免疫熒光法檢測。待檢血清樣本1∶100倍稀釋后進行檢測，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。每次試驗均設陰性和陽性對照。在EUROStar Ⅱ熒光顯微鏡下觀察熒光模式和熒光強度。ANA≥1∶100為陽性。

1.4.5HCV-RNA檢測 采用上海科華生物有限公司提供HCV-RNA熒光定量PCR儀檢測，HCV-RNA 檢出限為1×103copies/mL。所有操作步驟均嚴格按照說明書進行。HCV-IgG質控品由上海市臨床檢驗中心提供(HCV-RNA質控品批號：1801、1802)。

1.4.6丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測 采用速率法，檢測試劑盒購自上海科華生物工程公司，儀器為日立7600型全自動生化分析儀。

2 結 果

2.1LIA-ANAs在慢性丙型肝炎患者血清中的檢出情況 在81例慢性丙型肝炎患者標本中，共檢出LIA-ANAs陽性37例(45.68%)，陽性率顯著高于健康對照組4.94%(4/81)，且差異有統計學意義(χ2=33.300，P<0.001)。30例患者(37.04%)檢出1種自身抗體，占LIA-ANAs陽性者的81.08%(30/37)；檢出2種自身抗體6例(7.40%)，占LIA-ANAs陽性者的16.21%(6/37)；檢出3種自身抗體1例(1.23%),占LIA-ANAs陽性者的2.70%(1/37)。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs陽性和陰性組間年齡(t=0.720,P=0.479)、性別(χ2=0.400,P=0.520)差異無統計學意義。LIA-ANAs具體檢出情況見表1。

2.2慢性丙型肝炎患者血清ANA的檢出情況 81例慢性丙型肝炎患者血清ANA陽性6例，其中均質型1例,胞漿型2例,核仁型2例和顆粒型1例,見表2。然而，1例胞漿型和1例核仁型血清未檢出LIA-ANAs。

表1 慢性丙型肝炎患者和健康對照人群HCV抗體水平及LIA-ANAs表達

表2 6例ANA陽性慢性丙型肝炎患者ANA檢出情況

注：-表示此項未檢出LIA-ANAs。

表3 LIA-ANAs陰性組及陽性組年齡、性別、肝功能及HCV-RNA載量的比較

2.3慢性丙型肝炎患者HCV-RNA載量、性別、年齡、肝功能與LIA-ANAs的關系 81例慢性丙型肝炎患者中57例HCV-RNA<1×103copies/mL，24例HCV-RNA≥1×103copies/mL。LIA-ANAs 陽性組和陰性組間HCV-RNA載量的差異有統計學意義(χ2=4.645,P<0.05)。LIA-ANAs陽性組HCV-RNA載量高于陰性組。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs陽性和陰性組間年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)；2組ALT和AST 的中位數差異有統計學意義(P<0.05)，LIA-ANAs陽性組ALT和AST水平均高于陰性組，差異有統計學意義(U=595.000、597.500，P=0.038 2、0.040 3)。見表3。

3 討 論

大部分急性丙型肝炎患者會轉變為慢性病毒感染，反復慢性炎癥的作用導致肝纖維化，并引起機體內環境的紊亂，最終發展成為肝硬化，甚至肝細胞癌。近些年的研究表明，HCV 感染參與了自身免疫和免疫耐受平衡的破壞，促使致病性自身抗體的產生，從而引發自身免疫反應，肝臟組織纖維化的發生、發展與此密切相關[1]。在HCV感染者中已經揭示了一些與肝臟慢性感染相關的肝外表現，其中大多數可以通過免疫學機制介導，而不與肝外組織的直接感染有關，如類風濕關節炎、甲狀腺功能紊亂及自身免疫性肝病[5-7]。目前的研究報道對慢性丙型肝炎患者體內自身抗體與年齡、性別、肝功能及病毒載量等因素的相關性觀點不一致[8-10]。大部分的研究主要集中在丙型肝炎與ANA、平滑肌抗體的相關性研究[11-12]，與LIA-ANAs的相關性研究較少見。

本研究發現，在81例慢性丙型肝炎患者中共37例檢出LIA-ANAs，陽性率為45.68%，與AMICO等[12]的報道比較一致；且顯著高于健康對照人群。在LIA-ANAs陽性慢性丙型肝炎患者中絕大部分(81.08%)僅檢出1種自身抗體；檢出2種自身抗體的僅占16.21%；檢出3種自身抗體的比例則更低。然而，81例慢性丙型肝炎患者中ANA陽性僅6例(7.4%)，與LIA-ANAs 45.67%的檢出率明顯不符，可能與ANA間接免疫熒光法檢測的靈敏度較低有關。本研究還發現1例ANA胞漿型和1例核仁型患者血清均未檢出LIA-ANAs，這是否表明本研究所使用的15種LIA-ANAs尚不足以覆蓋慢性丙型肝炎患者體內產生的ANA種類？需要進一步擴大病例數來驗證。

在所有檢出的LIA-ANAs中Ro-52檢出率最高，在37例LIA-ANAs陽性患者中檢出Ro-52抗體有24例，比例高達64.86%。Ro-52是TRIM蛋白家族成員，在機體抗病原微生物等感染的固有免疫中起重要的調節作用；在細胞內可與多種分子相互作用，在核內可與DNA相互作用，發揮調節細胞增殖、凋亡、信號轉導等功能[13-14]。當免疫調節系統某些環節出現紊亂，表現出免疫自穩機制破壞，使Ro-52存在的微環境失衡，從而導致多種自身免疫性疾病發生，如干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡、皮肌炎等[15-16]。有研究分析了10年內北美地區Ⅰ型自身免疫性肝炎患者的流行病學資料發現，患者Ro-52抗體的陽性率高達37.3%[17]。在自身免疫性肝病中Ro-52抗體是患者出現肝損傷的原因還是結果，目前仍存在爭議。這些出現Ro-52抗體的丙型肝炎患者是否會出現嚴重的肝損傷？需要后續積累更多的病例加以分析。

慢性丙型肝炎患者自身抗體的出現，是否與病毒載量存在相關性，這對于患者的診斷和治療均較為重要。通過本研究分析發現慢性丙型肝炎患者中LIA-ANAs陽性者HCV-RNA載量明顯高于陰性者，可能是HCV 感染可導致肝細胞膜通透性增加或細胞膜抗原成分發生變異，誘發機體產生自身抗體所致[18]。這些自身抗體的存在是否誘發了機體免疫系統對肝細胞的免疫損傷或出現自身免疫和病毒感染破壞的疊加損傷？本研究發現慢性丙型肝炎LIA-ANAs陽性者血清ALT和AST水平高于參考區間的比例明顯高于陰性者，提示LIA-ANAs存在可能是引起肝臟組織損害的一個重要因素，也是導致肝外病理表現的原因。

4 結 論

在臨床上自身免疫性肝病與慢性丙型肝炎在治療原則上截然不同，如不恰當地使用干擾素治療可使自身免疫性疾病病情惡化，而盲目地應用免疫抑制劑又可加重患者的病毒血癥。因此，如何正確判斷是合并HCV感染的自身免疫性肝病，還是伴有自身免疫現象的慢性丙型肝炎，這對于疾病的診斷和鑒別診斷、患者的治療方向等有著極其重要的臨床意義。對慢性丙型肝炎患者血清進行LIA-ANAs的檢測，將有助于滿足臨床診治的需求。