不同類型腸易激綜合征患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a水平的臨床意義*

楊立順，康建華，沈興婭，李德來，馮紹華，李 娜

(天津市北辰中醫醫院檢驗科，天津 300400)

流行病學資料表明，我國腸易激綜合征(IBS)的患病率略低于西方國家。該病以腹痛或腹部不適為主要癥狀，是一種常見的功能性腸病[1]，患者常伴有排便習慣改變，上述癥狀在排便后可有所改善。臨床上可依據糞便的性狀將其分為便秘型IBS、腹瀉型IBS、混合型IBS及不確定型IBS。已有研究表明，各亞型IBS長期反復發作對患者生活質量的影響程度與一些慢性疾病，如糖尿病、充血性心力衰竭、腎衰竭等大體相同[2]。雖然，目前多種治療IBS藥物已應用于臨床，但尚存在爭議,如5-羥色胺受體拮抗劑雖然能夠抑制腹瀉型IBS患者小腸的運輸活力，降低結腸積氣，以緩解患者腹瀉癥狀，但在患者停藥后1周內易復發，不能取得滿意的療效[3]。近年學者也指出，IBS各亞型的發病機制均不是單一性的，但對于各亞型具體的發病機制仍缺乏了解[2]。

微小RNA(miRNA)是一種非編碼單鏈RNA分子，目前在生物界被實驗證實存在數目超過2萬，其參與轉錄后基因表達調控，并對腫瘤的發生和發展起到不同層面的作用。目前，多項研究報道指出，miRNA參與IBS的發生、發展。HOU等[4]研究發現，miRNA-144的上調可通過直接靶向作用于緊密連接蛋白和胞質緊密粘連蛋白1促進腸道通透性增高并損害上皮屏障的保護作用，并認為 miRNA-144可能是腸道通透性過高的關鍵調節因子，可能是腹瀉型IBS的潛在治療靶點。CHAO等[5]研究顯示，miRNA-29a通過降低IBS大鼠中水通道蛋白表達來增加結腸上皮細胞的腸膜通透性。HOU等[6]研究發現，miRNA-200a可通過靶向作用下調大麻素受體1和羥色胺轉運體來誘導內臟痛覺過敏，加重或促進IBS的進展。然而，上述3種miRNA在不同類型IBS患者中的表達情況尚未見報道。本研究擬針對不同類型IBS患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性及臨床意義進行分析，以期為IBS的病因學研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究主要通過病例抽樣法，選取IBS患者110例為研究對象，選取同期110例體檢健康者為健康對照。研究對象均抽樣于本院檢驗科，所有患者均為首次確診，收集時間為2015年10月至2018年6月。納入標準：(1)自愿參與，即了解本課題組的研究目后自愿接受研究的患者；(2)符合研究標準，即由本研究署名的醫院確診且全程在該醫院進行治療的患者。排除標準：(1)1年內參與過同類型研究的患者；(2)存在精神衛生問題與心理障礙的患者；(3)中途失訪的患者。

1.2方法 IBS不同類型的判定依據如下。(1)腹瀉型IBS：硬便或塊狀便排便比例<25%，稀便(糊狀便)或水樣便排便比例≥25%；(2)混合型IBS：稀便(糊狀便)或水樣便排便比例≥25%，硬便或塊狀便排便比例>25%；(3)便秘型IBS：稀便(糊狀便)或水樣便排便比例<25%，硬便或塊狀便排便比例≥25%；(4)不確定型IBS：糞便的性狀不符合上述三者之中的任一標準。

征得受試者同意的前提下對受試者進行生物采樣。受試者采樣前12 h低蛋白飲食，每位受試者取10 mL靜脈血樣本，靜脈血3 000 r/min離心后取上清并保存于-80 ℃冰箱備用。采用實時熒光定量反轉錄PCR(RT-PCR)測定受試者miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平。提取血清總RNA，并采用莖環法反轉錄為cDNA，進行RT-PCR檢測。檢測條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，42個循環。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。使用引物序列見表1。

表1 miRNA-144、miRNA-29a、miRNA-200a和U6引物序列

2 結 果

2.1不同類型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平比較 與健康對照(miRNA-144 6.16±1.44，miRNA-29a 0.21±0.05，miRNA-200a 0.14±0.03)相比，IBS患者(miRNA-144 15.92±4.86，miRNA-29a 1.40±0.27，miRNA-200a 1.33±0.20)表達水平均顯著增高(P<0.05)。不同類型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平對比結果顯示，混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平均顯著高于其他3種亞型(P<0.05)，不確定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平均顯著高于便秘型IBS及腹瀉型IBS(P<0.05)。見表2。

表2 不同類型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平對比

注：a表示方差分析有統計意義的基礎上與混合型IBS結果差異有統計學意義;b表示方差分析有統計意義的基礎上與不確定型IBS結果差異有統計學意義。

表3 便秘型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性(r)

注：a表示P<0.05。

表4 腹瀉型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性(r)

注：a表示P<0.05。

2.2不同類型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性 便秘型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性分析結果顯示，miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平存在統計學相關性(P<0.05)，而miRNA-144與miRNA-29a、miRNA-200a的表達水平不存在統計學相關性(P>0.05)，見表3。腹瀉型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性分析結果顯示，miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平存在統計學相關性(P<0.05)，而miRNA-144與miRNA-29a、miRNA-200a的表達水平不存在統計學相關性(P>0.05)，見表4。混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性分析結果顯示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平均存在兩兩之間的統計學相關性(P<0.05)，見表5。不確定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性分析結果顯示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平均存在兩兩之間的統計學相關性(P<0.05)，見表6。

表5 混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性(r)

注：a表示P<0.05。

表6 不確定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平的相關性(r)

注：a表示P<0.05。

3 討 論

本研究結果顯示，混合型、不確定型IBS患者miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a三者的表達水平均存在兩兩之間的統計學相關性，但對于單純腹瀉或便秘型的IBS患者來說，僅miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平存在統計學相關性，而miRNA-144與miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平不存在統計學相關性。上述研究結果提示，miRNA-29a和miRNA-200a的表達可能同時參與了4型IBS的發病，且二者之間存在相互協同的正相關關系。此外，miRNA-144可能參與混合型與不確定型IBS的發病。根據相關的文獻可知，miRNA介導IBS相關激惹性物質蓄積的信號通路是miRNA參與IBS發病的可能機制，且該基因對于多個細胞信號通路下游是關鍵的靶基因[7-9]，所以，從細胞生物學理論上來講，可以假設miRNA是一種IBS發生的上游信使物質，但IBS的發生具體被這種上游物質通過什么樣的作用模式調控，以及這種發生的概率及意義是否具有生物學和統計學方面的意義仍有待考證。

本研究還發現，混合型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平均顯著高于其他3種亞型，而不確定型IBS患者的miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平均顯著高于便秘型IBS及腹瀉型IBS。有研究發現，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a可下調緊密連接蛋白、胞質緊密粘連蛋白1、水通道蛋白、大麻素受體1和羥色胺轉運體等靶蛋白的表達活性，而這些靶蛋白的活性降低需要細胞外鈣離子的支持，這種現象稱為脫敏[4-6]。其生理學基礎是鈣的流入和細胞內鈣的相應增加，而IBS患者大多伴有不明原因的腸道部位鈍痛，且容易在不明的誘發因素下發生進一步激惹，因此，在一定程度上介導了這種效應[9]。各種信號傳導途徑(如鈣調神經磷酸酶、鈣調蛋白、磷脂酰肌醇二磷酸的減少)均與脫敏有關。有研究曾發現，IBS患者在經過較為長期的病程后會出現鈣通道調控蛋白部分結構域被激活的現象，并推測其原因可能為大量鈣離子的流入在一定程度上提高了痛覺觸發點位的閾值[7-9]。上述均提示，miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表達是IBS發病的重要基礎。

另外，水通道蛋白、大麻素受體1和羥色胺轉運體均具有2個特殊的末端結構(C-末端和N-末端)。C-末端主要負責參與痛覺的傳遞，N-末端則有一定的鎮痛作用，且該作用能被納洛酮翻轉。在相關的動物模型中，實驗人員模擬出受試動物形成腸道易激惹的生理環境，并通過不同的刺激模式觀察miRNA-29a和miRNA-200a水平與腸道易激惹程度是否存在線性變化的關系，結果顯示miRNA-29a和miRNA-200a能直接或間接誘導C-末端和N-末端的結構域發生變性，也可通過促進腦啡肽的釋放進一步促進谷氨酸等的釋放參與痛覺傳遞[5-6]。miRNA-29a和miRNA-200a可引起相應支配部位的神經區域出現血管擴張，繼而導致血漿蛋白外滲等炎性反應，而這也可能是IBS患者出現不明原因鈍痛且通過常規的鎮痛途徑效果并不明顯的一個主要因素[5-6]。有研究發現，IBS出現組織損傷和隨后的炎癥時，各種前列腺素和緩激肽的釋放也可在一定程度上誘導miRNA-29a和miRNA-200a的高表達[5-6]。同時，miRNA-29a和miRNA-200a的高表達對有害刺激(如高溫)的敏感性不是靜態的，某些情況下可因患者自身的生理狀況發生變化出現傷害感受器對有害刺激的敏感性增加[10-11]。鑒于miRNA-29a和miRNA-200a間有緊密的作用機制，可以解釋本次研究中miRNA-29a和miRNA-200a的表達水平在4種IBS亞型患者中均具有顯著的相關性，表明miRNA-29a和miRNA-200a可能通過相同的作用機制促進4種IBS亞型的形成。

4 結 論

混合型與不確定型IBS患者血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達水平較便秘型IBS及腹瀉型IBS 2種亞型高，且血清miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a表達兩兩之間均具有顯著相關性，提示miRNA-144、miRNA-29a和miRNA-200a的表達可能參與了混合型與不確定型IBS的發病。