miR-375靶向Pax6基因調控視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖凋亡的分子機制

桂玉敏 彭建軍 郭敬

視網膜母細胞瘤是視網膜中最常見的原發性惡性腫瘤，通常發生在嬰幼兒時期，占所有兒童惡性腫瘤的3%左右[1]。目前，盡管視網膜母細胞瘤的治療策略取得了一定的進展，但發生顱內及遠處轉移常危及患兒生命。鑒于此，有必要進一步探索視網膜母細胞瘤發生和發展的分子機制，并開發有效的治療方法，包括分子靶向治療。越來越多的證據表明，各種微小RNA(microRNA，miRNA)的異常表達通常存在于人類各種類型的癌癥中，包括視網膜母細胞瘤，這表明miRNA在癌癥發生和癌癥進展中的潛在功能[2-4]。miRNA是一類單鏈，長度約23個堿基的非編碼RNA，通過與mRNA的3'非翻譯區(UTR)結合，作為其靶mRNA的負調節因子，導致靶向降解或翻譯抑制。由于miRNA在癌癥起始和進展中的調節功能，應當將miRNA的靶向作為新的治療策略進行研究。多項研究表明，miR-375在食管癌、胃癌、骨肉瘤、宮頸癌等多種類型的癌癥中異常表達，發揮抑癌基因的作用[5-7]。然而，目前，miR-375影響人視網膜母細胞瘤細胞生物學過程的潛在分子機制仍然很大程度上未知。因此本研究探討miR-375對人視網膜母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響，并探究其靶基因，以期為視網膜母細胞瘤的靶向治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人視網膜母細胞瘤Y79細胞購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養基、胰蛋白酶和青鏈霉素購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；MTT試劑、二甲基亞砜購自美國Sigma公司；miR-375 mimics及陰性對照NC mimics購自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒及Western blot相關試劑購自碧云天生物技術研究所；Pax6抗體、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養及轉染 人視網膜母細胞瘤Y79細胞采用含10%胎牛血清+ RPMI1640培養液培養，置37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。根據細胞生長狀態每2 d更換1次培養液，細胞貼壁生長密度在80%以上時，以胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的Y79細胞鋪板，過夜培養，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染Y79細胞，其中轉染miR-375 mimics的Y79細胞記為miR-375組，轉染NC mimics的Y79細胞記為NC組，同時設置未轉染的Y79細胞為空白對照即Control組。轉染后各組Y79細胞置37℃培養箱繼續培養。

1.3 qRT-PCR檢測miR-375和Pax6 mRNA相對表達水平 收集轉染48 h的3組Y79細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，使用超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度和濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以合成的cDNA為模板使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行擴增，反應體系為：cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，去離子水7 μl。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組Y79細胞中miR-375相對表達水平，以GAPDH為內參，計算Pax6 mRNA相對表達水平。

1.4 MTT實驗檢測Y79細胞增殖活力 Control組、NC組和miR-375組Y79細胞接種到96孔板，接種密度為5×103個/孔，分別在轉染0、24、48、72 h時在每孔細胞中加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，于37℃下孵育4 h，除去上清，再在細胞中加入150 μl二甲基亞砜，避光溶解10 min，使用酶標儀檢測450 nm處吸光度值(A值)。

1.5 流式細胞儀實驗檢測Y79細胞凋亡情況 收集轉染48 h各組Y79細胞，預冷的PBS洗滌3次，加入適量Binding buffer緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為3×105/ml，取500 μl;細胞懸液，在細胞懸液中加入AnnexinⅤ-FITC溶液10 μl，混勻后再加入PI染色10 μl，混勻后室溫避光反應15 min，立即上流式細胞儀檢測。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗 通過TargetScan在線軟件預測miR-375的靶基因，發現Pax6 3’UTR區域與miR-375存在結合位點。根據生物信息學預測結合分別構建Pax6野生型(Pax6-Wt)和Pax6突變型(Pax6-Mut)的報告基因載體質粒，該步驟由上海生工生物工程有限公司完成。將對數期的Y79細胞種植在24孔板中，密度為1×105/孔，于37℃培養箱繼續培養。待Y79細胞貼壁后，分別將Pax6-Wt和Pax6-Mut載體質粒分別與miR-375 mimics或NC mimics共轉染Y79細胞，24 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別測定各組細胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎螢光素酶活性，統計細胞相對熒光素酶活性。

1.7 Western blot實驗檢測Y79細胞中Pax6蛋白表達水平 3組Y79細胞轉染48 h后，分別收集細胞，加入適量細胞裂解液提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后轉硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封阻2 h，TBST洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的Pax6一抗，4℃孵育過夜，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，使用ECL化學發光試劑盒顯影，轉移至暗室曝光，在凝膠成像系統掃描，以GAPDH為內參，使用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，計算各組Y79細胞中Pax6蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 miR-375 mimics轉染效率檢測 將miR-375 mimics及其陰性對照轉染至Y79細胞，采用qRT-PCR檢測轉染效率，結果顯示，miR-375組Y79細胞中miR-375相對表達水平明顯高于Control組和NC組(P<0.05)，Control組和NC組間miR-375相對表達水平相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 過表達miR-375可抑制Y79細胞增殖 MTT法檢測各組Y79細胞增殖活力，結果顯示，miR-375組24、48、72 h時Y79細胞A值顯著低于Control組和NC組(P<0.05)，Control組和NC組間24、48、72 h時Y79細胞A值相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別miR-375Control組 1.00±0.11NC組 0.97±0.09miR-375組3.18±0.34*#F值106.451P值0.000

注：與Control組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05

組別0 h24 h48 h72 hControl組 0.21±0.020.38±0.040.62±0.060.88±0.09NC組 0.20±0.020.37±0.040.59±0.060.85±0.08miR-375組0.21±0.020.28±0.03*#0.38±0.04*#0.51±0.05*#F值0.2506.65917.48922.359P值0.7870.0000.0030.000

注：與Control組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05

2.3 過表達miR-375促進Y79細胞凋亡 流式細胞儀檢測各組Y79細胞凋亡率，miR-375組Y79細胞凋亡率顯著高于Control組和NC組(P<0.05)，Control組和NC組間細胞凋亡率相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1,表3。

圖1 流式細胞儀檢測Y79細胞凋亡率

組別凋亡率Control組 6.02±1.13NC組 6.12±1.15miR-375組18.42±3.35*#F值33.106P值0.001

注：與Control組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05

2.4 miR-375靶向調控Pax6基因 通過生物信息學工具Targetscan預測結果顯示，miR-375與Pax6基因3’UTR存在靶向結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，Pax6-Wt共轉染組中miR-375細胞的相對熒光素酶活性明顯低于NC組(P<0.05)，Pax6-Mut共轉染組細胞的相對熒光素酶活性無明顯改變(P>0.05)。qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，miR-375組Y79細胞中Pax6 mRNA和蛋白表達水平明顯低于NC組(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-375靶向調控Pax6的表達

注：A：TargetScan軟件預測miR-375與Pax6靶向結合位點；B：雙熒光素酶報告基因實驗檢測Pax6是miR-375的靶基因；C：qRT-PCR和Western blot檢測轉染過表達miR-375對Pax6 mRNA和蛋白表達的影響;與NC組比較，*P<0.05

3 討論

視網膜母細胞瘤發生和發展涉及多種因素，包括癌基因和腫瘤抑制基因的遺傳和表觀遺傳改變，并且之前已經證明這些因子可調節細胞生長，細胞周期和細胞凋亡。研究顯示，miRNA可能在癌癥包括視網膜母細胞瘤中起著致癌基因或腫瘤抑制因子的作用，這取決于它們的靶mRNA[8]。miRNA參與多種生理和病理過程，包括細胞增殖，細胞周期，細胞凋亡，分化，血管生成，遷移，侵襲和轉移[9]。miR-375位于染色體2q35上，越來越多的研究表明，miR-375在許多類型癌癥中的表達水平下調，包括頭頸部鱗狀細胞癌，肝細胞癌和肺癌等[10,11]。在前列腺中，miR-375的表達顯著下調，并且其低表達水平與腫瘤分期，組織學分級和淋巴結轉移密切相關[12]。在結直腸癌中，與鄰近的非腫瘤組織相比，miR-375在結直腸癌組織中的表達水平顯著降低，體外功能探究實驗顯示，miR-375通過靶向sp1在轉錄后水平抑制sp1表達來抑制結腸直腸癌細胞的增殖[13]。miR-375在胃癌細胞中表達下調，miR-375的異位表達在體外和體內抑制腫瘤生長，miR-375通過靶向YAP1-TEAD4-CTGF軸參與該過程[14]。Cao等[15]研究發現，miR-375靶向血小板衍生生長因子-α抑制口腔鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲。Venkatesan等人通過生物信息學分析以預測與視網膜母細胞瘤發病相關的miRNA，結果發現miR-375表達水平顯著降低[16]。然而，目前關于miR-375在視網膜母細胞瘤中的作用及機制尚不清楚。本實驗通過細胞功能實驗發現，過表達miR-375能夠抑制視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖，誘導細胞凋亡，本實驗結果表明miR-375在人視網膜母細胞瘤中亦發揮抑癌作用。

鑒定miR-375靶基因對于了解其在視網膜母細胞瘤癌發生和發展中的功能以及探索視網膜母細胞瘤的新靶向療法是必不可少的。在本研究中，證實了涉及miR-375靶向Pax6的分子機制。首先，通過生物信息學在線軟件TargetScan預測Pax6是miR-497的潛在靶標。其次，通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測顯示miR-375直接靶向Pax6 3'-UTR。最后，通過qRT-PCR和蛋白質印跡分析顯示miR-375在mRNA和蛋白質水平下降低Pax6的表達水平。這些實驗結果表明miR-375通過直接靶向Pax6抑制視網膜母細胞瘤的發生和發展。Pax6是PAX家族的成員，是與眼睛和中樞神經系統發育相關的重要轉錄因子[17]。目前已確定表達失調的Pax6涉及不同類型的人類癌癥，包括胰腺癌、非小細胞肺癌、視網膜母細胞瘤、神經膠質瘤和結腸直腸癌等[18,19]。目前已證明PAX6受癌癥中多種miRNA的調節。在骨肉瘤中，miR-19通過靶向Pax6促進體外骨肉瘤細胞的惡性表型[20]。miR-655通過直接靶向PAX6并抑制ERK和p38 MAPK信號通路，減弱視網膜母細胞瘤細胞的惡性生物學行為[21]。Zou等[22]報道顯示，miR-375靶向Pax6并抑制人乳腺癌MCF-7細胞的活力，遷移和侵襲。本研究證實miR-375負調節Pax6的表達水平，抑制視網膜母細胞瘤的細胞增殖，促進細胞凋亡。總之，這些發現表明基于miR-375/Pax6的靶向治療可能是視網膜母細胞瘤的新療法。

總之，本研究揭示miR-375通過直接靶向Pax6顯著降低視網膜母細胞瘤細胞中的細胞增殖能力，誘導細胞凋亡。實驗結果表明miR-375通過靶向Pax6在抑制視網膜母細胞瘤的發生和發展中起重要作用，應作為視網膜母細胞瘤的潛在新型靶向治療進行研究。