HCY及MTHFR多態性與冠心病易感性的關系

遲潔 宮艷艷 鄭霄 楊娜 姚筱

冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，隨著吸煙、高血脂、糖尿病和高血壓等多種危險因素的影響，其患病率呈逐年升高的傾向。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含硫氨基酸的蛋白質代謝的中間產物。相關文獻顯示，Hcy明顯增加血管粥樣硬化的風險，進而參與冠心病的發生發展[1]。謝軍等[2]研究亦表明，高Hcy血癥史心腦血管病發生的獨立危險因素。葉酸代謝相關酶亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝過程的主要蛋白酶，可能受地域、種族等多種因素的影響。MTHFR 基因突變影響MTHFR 酶活性，最終影響Hcy代謝，而關于Hcy及MTHFR多態性與冠心病易感性之間關系的確切結論尚未明確[3]。本研究探討血漿Hcy及MTHFR C677T、A1298C多態性與冠心病的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2018年1月至2019年1月期間心內科住院部收治的185例冠心病患者作為病例組，年齡40～86歲，同期選取180例年齡相匹配的非冠心病患者作為對照組。2組在性別比、年齡、體重指數、吸煙史、高血壓病史、高脂血癥病史和遺傳病家族史等一般資料之間的比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料之間的比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準[4]：病例組患者符合冠心病的診斷標準,經冠脈造影證實右冠狀動脈、回旋支、左前降支、左主干中血管狹窄>50%。對照組排除冠心病的診斷，全部研究對象均簽署知情同意書和倫理志愿書。

1.2.2 排除標準[5]：嚴重肝腎功能障礙、自身免疫性疾病、心力衰竭、糖尿病、銀屑病、硬皮病、貧血、消化道病變、腫瘤、風濕性疾病、甲狀腺功能低下、近期服用阿扎立平、避孕藥、環孢素、甲氧芐氨嘧啶、甲氨蝶呤、卡馬西平、苯妥英鈉、維生素B12、維生素B6、葉酸等影響Hcy代謝的藥物。

1.3 檢測方法

1.3.1 血漿Hcy：全部研究對象采集空腹(禁食12 h)靜脈血10 ml置于EDTA抗凝管內，1 h內采用離心轉速(3 000 r/min)，離心半徑(8 cm)進行離心操作5 min，使用全自動生化分析儀(日立7 600，日本Hitachi公司)通過酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定血漿Hcy水平，嚴格按照試劑盒(深圳奧薩制藥公司)說明書進行操作，正常參考值為1～10 μmol/L。

1.3.2 MTHFR：使用無菌棉拭子在口腔內側刮拭40次以上，以略鼓起為適宜，采集口腔黏膜上皮細胞，采用反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測MTHFR C677T位點、A1298C位點基因型。首先使用核酸提取試劑盒(上海百傲科技公司)提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。PCR引物(MTHFR C677T-上游5’-GAAAAGCTGCGTGATGATG-3’，下游5’-TTGAAGGAGAAGGTGTC-3’，MTHFR A1298C-上游5’-AAGAAGAAGACTTCAAA-3’、下游5’-TGGGGGGA

GGAGCTGAC-3’)。Taqman-MGB 探針基因序列(MTHFR C677T-V2 5’-AATCGGCTCCCGC-3’、MTHFR

C677T-M2 5’-AATCGACTCCCGC-3’，MTHFR A1298C-V2 5’-ACACTTGCTTCACT-3’、MTHFR A1298C-M2 5’-ACACTTTCTTCAC T-3’)。試劑盒和儀器均由美國應用生物系統(Applied Biosystems，ABI)公司提供，使用Taqman-MGB技術檢測，對2個位點進行熒光定量PCR反應，體系10 μl(去離子水3.5 μl，Taqman-MGB 探針0.5 μl，Taqman Universal Master Mix 5 μl，20 mg/L DNA模板1 μl)，條件：95 ℃預變性10 min→(92℃變性15 s、60℃退火延長1 min)×20cycles，擴增→(89℃變性15 s、60℃退火延長1.5 min)×30cycles，擴增。在熒光定量 PCR 儀(7900，ABI 公司)的熒光端讀取樣品孔，軟件分析各樣本的基因分型。

2 結果

2.1 2組MTHFR位點基因頻率分布情況 MTHFR C677T位點基因型主要包括 TT、CT和CC，MTHFR A1298C位點基因型主要包括 CC、AC和AA。病例組MTHFR C677T、A1298C 位點基因多態性的檢驗結果符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=1.014、0.501，P>0.05)，對照組檢驗結果亦符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=0.415、0.741，P>0.05)，表明樣本具有群體代表性。病例組MTHFR C677T位點TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于對照組，CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯低于對照組，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，2組MTHFR A1298C位點CC、AC、AA基因型頻率和等位基因頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 2組MTHFR位點基因頻率分布情況 例(%)

表3 2組MTHFR等位基因頻率分布情況 例(%)

2.2 2組血漿Hcy水平的關系 病例組血漿Hcy水平明顯高于對照組(P<0.05)，按MTHFR C677T基因型分布，2組 TT、CT和CC基因型血清Hcy水平依次降低，TT基因型血清Hcy水平明顯高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明顯高于CC基因型(P<0.05)。按MTHFR A1298C基因型分布，CC、AC和AA血清Hcy水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

組別HcyMTHFR C677TTTCTCCMTHFR A1298CCCACAA病例組(n=185)17.54±11.0322.01±13.0116.61±9.96*12.36±8.01*#15.14±6.9416.02±8.0118.58±9.91對照組(n=180)10.85±8.1214.11±5.0111.02±3.98*9.01±4.02*#10.23±4.1510.39±5.2811.17±6.03t值6.5847.6167.0055.0298.1767.9068.601P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與TT比較，*P<0.05；與CT比較，#P<0.05

2.3 Hcy及MTHFR位點基因與冠心病易感性的關系 攜帶MTHFR C677T TT位點基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的獨立危險因素(OR=2.068，2.154，P<0.001)，攜帶MTHFR C677T CC位點基因型是冠心病的獨立保護因素(OR=0.502，P<0.001)。見表5。

表5 MTHFR位點基因與冠心病易感性的關系

3 討論

Hcy是蛋氨酸的中間代謝產物，其含量增加導致血管粥樣硬化的機制主要包括：(1)通過上調血管內皮細胞Fas，增加血管內皮素-1，導致血管內皮細胞功能障礙。(2)通過氧化自由基、抑制前列環素和一氧化氮的形成，導致血管內皮損傷和高血壓。(3)通過誘導祖細胞凋亡、內質網應激和促進膠原纖維形成導致血管平滑肌增生和血管硬化。易志強等[6]研究表明，高Hcy血癥是冠心病的獨立危險因素。MTHFR是Hcy再甲基化代謝途徑的主要蛋白酶，且具有多態性[7]。當MTHFR基因突變可導致酶活性下降，導致Hcy代謝異常而導致血漿Hcy水平增高。相關文獻顯示，MTHFR多態性與高血壓及冠心病具有緊密的關系[8]。而胡晨鳴等[9]研究則表明，MTHFR多態性與冠心病無明顯關系。因此，臨床上更致力于Hcy及MTHFR多態性與冠心病易感性之間關系的研究。

本研究結果顯示，與非冠心病患者比較，冠心病患者血漿Hcy水平明顯增高，與陳映慧等[10]結果相一致。Hcy的機體代謝可能受維生素B12、維生素B6、葉酸和MTHFR代謝酶活性等因素的影響[11]。其中MTHFR代謝酶是Hcy代謝途徑中的主要蛋白酶之一，其活性下降可能導致血漿Hcy水平明顯增高。MTHFR基因突變可能導致酶活性明顯降低，Hcy水平明顯升高，進而增加冠心病的風險。相關文獻顯示，MTHFR基因主要包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C位點，但研究發現這2個位點基因與冠心病關系的研究結論尚不一致，甚至相反[12]。本研究顯示，MTHFR C677T位點基因型主要包括 TT、CT和CC ，其中以CT型所占比例最高，MTHFR A1298C位點基因型主要包括CC、AC和AA，其中以AA型所占比例最高，與相關文獻結果[13]一致。進一步研究顯示，冠心病患者MTHFR C677T位點TT基因型頻率和T等位基因頻率較非冠心病患者明顯增高，CC基因型頻率和C等位基因頻率較非冠心病患者明顯降低，提示MTHFR C677T位點多態性與冠心病具有緊密的關系，攜帶T等位基因的人群出現冠心病的風險較高，T等位基因可作為冠心病的易感基因[14]。進一步研究結果顯示，MTHFR C677T TT基因型血清Hcy水平明顯高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明顯高于CC基因型，與何冠軍等[15]研究結果相一致。由此可推斷，與攜帶MTHFR C677T CT、CC位點基因型患者比較，攜帶TT基因可更明顯促使Hcy水平升高，加重冠心病的風險[16]。而本研究就MTHFR A1298C基因型分布進行研究發現，冠心病患者與非冠心病患者2組MTHFR A1298C位點CC、AC、AA基因型頻率和A、C等位基因頻率比較差異無統計學意義，且CC、AC和AA基因型血清Hcy水平無明顯差異，可見MTHFR A1298C基因多態性與冠心病無明顯關系，與相關研究結果[17]一致。趙艷梅等[18]研究表明，MTHFR C677T位點基因突變可能導致蛋白酶由于熱不穩定所致活性降低，導致Hcy再甲基化代謝異常，最終導致Hcy水平明顯增高，增加冠心病的風險?？梢奌cy及其代謝酶MTHFR 活性的異常改變是冠心病的易感因素。筆者認為，在冠心病的預防和治療期間，重視Hcy及其代謝酶(MTHFR)多態性對臨床干預方案的制定具有重要的指導作用，但由于冠心病受多種病理因素的影響，在制定臨床干預方案期間仍需綜合考慮地域、性別、年齡、合并癥等因素。因此，MTHFR C677T位點基因多態性可能參與冠心病的發生發展期間。

綜上所述，攜帶MTHFR C677T TT位點基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的獨立危險因素，攜帶MTHFR C677T CC位點基因型是冠心病的獨立保護因素，Hcy升高和MTHFR TT基因廣泛分布可作為冠心病的易感因素參與疾病發生發展期間。但由于本研究樣本量較少，結果容易出現偏倚，更確切的結論尚有待多中心大樣本的研究探討。