miR-34a和SIRT1在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)及意義

周冰皓 邱菊 田艷杰 李秋爽

子癇前期是妊娠期特有的疾病，是指妊娠20周以后，孕婦出現(xiàn)高血壓和蛋白尿等癥狀，并伴有疼痛、惡心、上腹不適癥狀，可發(fā)展為子癇，導(dǎo)致母嬰不良結(jié)局。子癇前期病因及病理機制較為復(fù)雜，涉及多系統(tǒng)紊亂[1]。有研究表明，胎盤灌注不足是引起子癇前期的因素之一，而胎盤灌注不足由滋養(yǎng)層細(xì)胞異常凋亡引起[2]。近年來miRNA與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系成為子癇前期發(fā)病機制的研究熱點，有文獻(xiàn)表明，miR-34a與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3]，但有關(guān)miR-34a在子癇前期中研究較少。另有研究表明沉默信息調(diào)控子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且SIRT1是miR-34a的靶基因[4]，因此本研究主要分析子癇前期患者胎盤組織miR-34a、SIRT1表達(dá)情況，探討二者在子癇前期過程中可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年9月至2018年9月住院擇日行剖宮產(chǎn)的子癇前期患者63例，根據(jù)病情程度分為子癇前期輕度組29例，年齡(31.21±4.33)歲；孕周(28.35±2.47)周。子癇前期重度組34例，年齡(30.91±4.18)歲，孕周(27.61±3.05)周。另選取同期因胎位不正等原因經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩的正常妊娠孕婦31例作為對照組，年齡21～39歲，平均年齡(30.76±3.38)歲，孕周(28.42±2.07)周。3組間孕婦年齡及孕周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有樣品采取得患者及家屬知情同意并簽字。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：子癇前期納入標(biāo)準(zhǔn)：符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；患者及家屬選擇接受剖宮術(shù)分娩；患者均為單胎初次妊娠。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：輔助生殖技術(shù)受孕者；孕前患有高血壓者；嚴(yán)重的腎病、慢性高血壓、自身免疫病、肝病；妊娠期糖尿病、胎盤早剝等其他產(chǎn)科并發(fā)癥。

1.3 子癇前期分度標(biāo)準(zhǔn) 按照第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，(1)輕度：①妊娠20周后孕婦收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90mm Hg；②蛋白尿≥0.3 g/24 h或隨機尿蛋白(+)。(2)重度：孕婦血壓和尿蛋白持續(xù)性上升，出現(xiàn)以下任一條癥狀者即可診斷為子癇前期重度。①孕婦血壓持續(xù)上升，收縮壓≥160 mm Hg和(或)舒張壓≥1 100 mm Hg；②蛋白尿≥5.0 g/24 h或隨機尿蛋白(+++)；③肝酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量升高，肝功能異常；④尿量<17 ml/h或尿量<400 ml/24 h或血肌酐>106 μmol/L，腎功能異常；⑤貧血、血管內(nèi)溶血、黃疸或血小板<100×109/L；⑥上腹部持續(xù)性疼痛、發(fā)生肝包膜下血腫或肝破裂；⑦持續(xù)性頭痛、視覺發(fā)生障礙或其他腦神經(jīng)損傷癥狀；⑧羊水過少、胚胎生長受限。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集:所有研究對象胎盤娩出后10 min內(nèi)從近臍帶附著處切取1 cm×1 cm×0.2 cm胎盤全層組織兩塊。用預(yù)冷的0.9%滅菌氯化鈉注射液快速沖洗3次，去除血污，其中1塊組織用滅菌濾紙吸去水分，裝入1.5的EP管中，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫涣?塊組織放入10%中性甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明浸蠟后，石蠟包埋成塊備用。

1.4.2 實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantification PCR，qRT-PCR)法檢測胎盤組織miR-34a、SIRT1 mRNA相對表達(dá)量:采用qRT-PCR法檢測研究對象胎盤組織中miR-34a及SIRT1 mRNA相對表達(dá)量。按照Trizol試劑盒說明書操作提取組織總RNA，按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。qRT-PCR反應(yīng)體系共為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，ddH2O 6.0 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共40個循環(huán)。miR-34a及SIRT1分別以U6、GAPDH為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34a、SIRT1 mRNA相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 免疫組化法檢測胎盤組織中SIRT1蛋白表達(dá)情況:取1.2.1中石蠟包埋的胎盤組織切片，以4 μm的厚度切片并采用免疫組化法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，DAB(二氨基聯(lián)苯氨)顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，采用蘇木素復(fù)染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。在200倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個切片中選取10個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。采用半定量積分法判定結(jié)果：陽性細(xì)胞百分比×染色程度。陽性細(xì)胞百分比：<5%記為0分；5%～25%記為1分；26%～50%記為2分；>50%記為3分。染色程度：無色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。取陽性百分比和染色程度計分之乘積：≤2分為陰性，>2分為陽性。

2 結(jié)果

2.1 3組孕婦臨床資料比較 與對照組孕婦相比，子癇前期輕度組、重度組收縮壓、舒張壓、平均脈動壓、24 h 蛋白尿升高(P<0.05)；且子癇前期重度組孕婦收縮壓、舒張壓、平均脈動壓、24 h蛋白尿水平高于子癇前期輕度組(P<0.05)。見表2。

項目對照組(n=31)子癇前期輕度組(n=29)子癇前期重度組(n=34)F值P值收縮壓(mm Hg)112.18±28.05147.31±36.83*170.39±42.60*#20.749<0.001舒張壓(mm Hg)84.15±21.04100.18±25.05*120.27±30.07*#15.988<0.001平均動脈壓(mm Hg)102.84±25.71131.60±32.90*153.68±38.42*#19.335<0.00124 h尿蛋白(g/24 h)0.12±0.040.87±0.31*5.35±1.24*#444.63<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與子癇前期輕度組比較，#P<0.05

2.2 3組孕婦胎盤組織中miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá)水平 3組孕婦胎盤組織miR-34a、SIRT1 mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組孕婦相比，子癇前期輕度組、重度組胎盤組織miR-34a表達(dá)顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與子癇前期輕度組孕婦相比，子癇前期重度組胎盤組織miR-34a水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3。

組別miR-34aSIRT1 mRNA對照組(n=31) 1.01±0.211.03±0.20子癇前期輕度組(n=29)1.79±0.33*0.64±0.11*子癇前期重度組(n=34)2.18±0.54*#0.35±0.07*#F值74.007201.254P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與子癇前期輕度組比較，#P<0.05

2.3 3組孕婦胎盤組織中SIRT1蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示SIRT1位于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞質(zhì)中。與對照組孕婦比較，子癇前期輕度組、子癇前期重度組SIRT1蛋白陽性表達(dá)率降低(P<0.05)；與子癇前期輕度組孕婦比較，子癇前期重度組SIRT1蛋白陽性表達(dá)率降低(P<0.05)。見圖1，表4。

SIRT1表達(dá)陽性 SIRT1表達(dá)陰性

圖1 胎盤組織中SIRT1蛋白表達(dá)(免疫組化×200)

2.4 子癇前期孕婦胎盤組織中miR-34a和SIRT1 mRNA表達(dá)相關(guān)性 Pearson相關(guān)性顯示：miR-34a表達(dá)與SIRT1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.874，P<0.05)。見圖2。

表4 3組胎盤組織SIRT1蛋白表達(dá)情況 例

圖2 子癇前期胎盤組織miR-34a和SIRT1 mRNA相關(guān)性分析

3 討論

子癇前期是造成母嬰不良結(jié)局的產(chǎn)科并發(fā)癥之一，全球發(fā)病率為5%～8%，其發(fā)病機制尚未完全闡明。相關(guān)研究表明，子癇前期的發(fā)生涉及滋養(yǎng)層細(xì)胞異常凋亡、血流灌注異常、炎性反應(yīng)等諸多原因。有研究表明，miR-34a、SIRT1與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且SIRT1是miR-34a的靶基因[3,4]，因此本研究主要探討子癇前期患者胎盤組織中miR-34a、SIRT1表達(dá)情況。

目前認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞異常凋亡與子癇前期疾病密切相關(guān)，正常情況下，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞以類似惡性腫瘤細(xì)胞樣的行為侵入到子宮螺旋動脈周圍，破壞肌層和彈性組織，并替代血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)子宮螺旋動脈重構(gòu)，使其管徑擴張，胎盤血流灌注增加。而孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡引起子宮螺旋動脈重塑異常，造成胎盤血流灌注不足，胎盤缺氧、缺血，引發(fā)胎盤和內(nèi)皮組織損傷，在孕20周后導(dǎo)致血壓高血壓、蛋白尿等母體癥狀，發(fā)生子癇前期[6-8]。近年大量研究表明表明，SIRT1蛋白參與多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括子宮內(nèi)膜癌[9]、卵巢癌[10]、胃癌[11]等。在哺乳動物細(xì)胞中，SIRT1可通過減少p53乙酰化抑制細(xì)胞凋亡[12]。Li等[13]研究表明，乳腺癌患者癌組織SIRT1表達(dá)量顯著高于其癌旁組織，提示SIRT1在乳腺癌中發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用。Lee等[14,15]研究表明，SIRT1通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，在肝癌、大腸癌中發(fā)揮促癌作用。以上研究提示SIRT1表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示SIRT1蛋白主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦胎盤組織中SIRT1 mRNA表達(dá)量、SIRT1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于正常孕婦，且重度組低于輕度組，表明SIRT1低表達(dá)可能與子癇前期發(fā)生有關(guān)，且與子癇前期病情嚴(yán)重程度有關(guān)。推測SIRT1表達(dá)下調(diào)，可能通過加速滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，致使胎盤血流灌注不足，胎盤缺氧、缺血，引發(fā)胎盤和內(nèi)皮組織損傷，參與子癇前期疾病發(fā)生。

miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，通過與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄。miR-34a位于1號染色體的3區(qū)6帶，有兩個外顯子。miR-34a通過靶向HMGB1促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[16]。Yang等[17]研究表明，miR-34a在誘導(dǎo)胃癌癌細(xì)胞凋亡。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測表明，子癇前期孕婦胎盤組織miR-34a表達(dá)量顯著高于正常孕婦，且隨子癇前期病情加重表達(dá)量升高，提示miR-34a與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。Yan等[18]研究表明，SIRT1是miR-34a的靶基因，miR-34a通過下調(diào)SIRT1表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Pearson法分析顯示，子癇前期孕婦胎盤組織中miR-34a與SIRT1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，猜測在子癇前期患者中，miR-34a可能通過調(diào)控SIRT1表達(dá)參與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡進(jìn)程，影響子癇前期疾病發(fā)生。此外另有研究表明miR-34a可通過通過抑制DLL1的表達(dá)抑制胎盤血管生成。因此推測miR-34a可能通過調(diào)節(jié)不同靶基因表達(dá)，共同參與子癇前期發(fā)生發(fā)展過程，相關(guān)機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，子癇前期孕婦胎盤組織中miR-34a高表達(dá)，SIRT1蛋白低表達(dá)，miR-34a可能通過負(fù)調(diào)控SIRT1蛋白參與子癇前期過程。本研究也存在一定不足，相關(guān)機制有待進(jìn)一步研究。