lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中的表達及意義

周晴 謝玉秀 樊秀婷

新生血管性青光眼是繼發性青光眼的一種形式，也是重要的糖尿病視網膜病變，其病理特征為在虹膜和(或)前房角處有新血管形成[1-3]。研究表明，新血管形成隨后的炎性反應是糖尿病新生血管性青光眼的特征，并可導致玻璃體出血或牽拉性視網膜脫離[4，5]。在患有糖尿病新生血管性青光眼中鑒定了各種炎性因子，如前列腺素F2(prostaglandin F2,PGF2)炎性細胞因子LTC4等。長非編碼RNA(Long noncoding RNAs，LncRNA)被認為是長度超過200個核苷酸的轉錄物，并且在結構上與沒有蛋白質編碼功能的mRNA相似[6，7]。 LncRNA參與多種生物過程，如細胞凋亡，染色體印記和表觀遺傳調控。轉移相關的肺腺癌轉錄物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種lncRNA，據報道，在糖尿病視網膜病變的小鼠和RF/6A細胞模型以及糖尿病患者的房水和纖維血管膜中，其表達明顯上調[8]。lncRNA MALAT1還可通過活化p38MAPK，ERK和c-Jun N末端激酶(JNK)的應激激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)激活一系列炎性反應因子。研究發現白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-6(interleukin-2，IL-6)、超敏C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能由lncRNA MALAT1調控[9]。本研究擬探討lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中的表達及意義，為糖尿病新生血管性青光眼的治療提供理論及臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年11月在我院眼科確診的在糖尿病新生血管性青光眼患者92例作為病例組，所有患者散瞳后檢查眼底，做熒光素鈉眼底血管造影(術前因晶狀體混濁看不清眼底的患者，于術后 l 周進行眼底檢查)。同期選擇本院虹膜無新生血管的慢性閉角型青光眼患者92例為對照組，對照組無糖尿病并且通過75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)進行測試。對照組、病例組組別間基礎資料見表1。本研究根據赫爾辛基宣言的原則進行，并獲得本院倫理審查委員會的批準。在解釋研究目的和程序后，所有患者簽署知情同意書。本研究排除6個月內接受了眼部手術的患者，同時全身重大疾病患者也被排除在外。2組在性別比、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓的水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同組別間基礎資料的比較 n=92

1.2 虹膜組織的獲取 病例組及對照組在行小梁切除術行虹膜根切時留取虹膜組織。立刻置于液氮保存。

1.3 儀器與試劑 MK3-3酶標儀(美國熱電)、熒光定量PCR儀(德國耶拿分)、lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α Elisa試劑盒購于上海邦奕生物科技有限公司。Trizol RNA提取試劑和逆轉錄(RT)試劑盒購自美國的Invitrogen Corporation(City，State，USA)，lncRNA MALAT1 RNA定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自上海GenePharma有限公司。使用的TePCR熱循環儀是Roche LightCycler(Kaiseraugst，Rheinfelden，Switzerland)。

1.4 lncRNA MALAT1蛋白在病例組及對照組虹膜組織表達水平測定 通過使用1.3 lncRNA MALAT1兔多克隆抗體和抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體，在4 μm石蠟包埋的組織切片上進行1.3 lncRNA MALAT1蛋白表達的檢測。使用3%過氧化氫溶液和蛋白質阻斷試劑來終止蛋白質的酶活性和非特異性結合。組織切片的抗原修復在Tris EDTA緩沖液(pH值9.0)中進行。用二氨基聯苯胺(DAB)底物和Mayer’s蘇木精復染物檢測陽性染色。以高放大倍數(40x)觀察500個細胞。在至少5個視野中使用半定量方法對染色的組織切片進行評分。染色標準為0表示<5%陽性染色細胞(陰性表達)，+表示5%～20%陽性染色細胞(弱表達)，2+表示21%～50%陽性染色細胞(中度表達)和3+為> 50%陽性染色細胞(強表達)。

1.5 ELISA測定病例組及對照組虹膜組織 lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平 按照無菌條件操作，稱取微量虹膜組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將虹膜組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入2 ml Eppendorf管中，加入1.2 ml PBS(pH值7.4)，充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細收集上清液。獲取虹膜組織組織勻漿后，采用Elisa法檢測lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平。

1.6 病例組及對照組虹膜組織 lncRNA MALAT1mRNA水平的測定 qRT-PCR用于lncRNA MALAT1基因的相對mRNA表達。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germany)從所有組織樣品中分離總RNA。使用Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystem，USA)通過PCR擴增通過逆轉錄合成互補DNA(cDNA)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystem，USA)和用于lncRNA MALAT1的特異性引物在Lightcycler 96系統(Roche，USA)上進行qRT-PCR：lncRNA MALAT1正向引物5’-CTATCGAAGGGACCTAG-3’，反向引物5’-ACCTACTTCAGCAGGCCTCG-3’(產品規格為150 bp)。β-肌動蛋白用作內部對照，引物序列是：正向5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’反向5’AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’(產物大小179 bp)。每份樣品的qRT-PCR反應一式三份進行。TLR4、NF-кB的qRT-PCR熱曲線為94℃：10 min、94℃：30 s、58℃：35 s、72℃：1 min；45個循環。通過相對基因定量方法(2-ΔΔCT方法)計算mRNA倍數變化。

2 結果

2.1 2組lncRNA MALAT1 蛋白表達評分比較 病例組lncRNA MALAT1蛋白表達評分高于對照組 (P<0.01)。見表2。

組別lncRNA MALAT1 對照組0.74±0.14病例組5.12±0.53t值29.369P值<0.001

2.2 2組中lncRNA MALAT1蛋白表達陰性率比較 病例組lncRNA MALAT1蛋白表達陽性率明顯高于對照組(P<0.01)；免疫組化法下，lncRNA MALAT1陽性表達為棕褐色，lncRNA MALAT1陽性表達情況與其蛋白表達水平符合。見表3，圖1。

2.3 2組lncRNA MALAT1 mRNA表達水平比較 病例組lncRNA MALAT1 mRNA表達水平高于對照組(P<0.01)。見表4。

表3 2組lncRNA MALAT1蛋白表達陰性率比較 n=92，例(%)

圖1 lncRNA MALAT1在對照組、病例組的表達；A 在青光眼虹膜組織中表達；B 在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織表達

組別lncRNA MALAT1 mRNA對照組1.01±0.21病例組3.54±0.55t值20.364P值<0.001

2.4 2組組各炎癥指標水平比較 病例組IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

項目對照組病例組t值P值IL-2(pg/ml)85.63±12.36263.65±48.6385.365<0.001IL-6(pg/ml)102.36±10.12329.32±36.9859.654<0.001hs-CRP(μmol/L)102.16±10.15367.12±26.1949.365<0.001TNF-α(mmol/L)25.49±1.92102.23±5.2358.219<0.001

2.5 lncRNA MALAT1蛋白表達評分、lncRNA MALAT1 mRNA與各變量的相關性分析 lncRNA MALAT1蛋白表達評分、lncRNA MALAT1 mRNA與IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α呈正相關差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 lncRNA MALAT1 蛋白表達評分、lncRNA MALAT1 mRNA與各變量的相關性分析

3 討論

哺乳動物基因組包含數千個lncRNA基因，由于在許多生物過程和障礙中的潛在作用，它們已引起廣泛關注[10]。最近，lncRNAs在血管生物學中的作用已逐漸被認識到。人冠狀動脈平滑肌細胞的RNA測序鑒定了31個未注釋的lncRNA，其中，lncRNA-SENCR被發現是富含血管細胞的lncRNA，其敲低導致心肌素和平滑肌收縮基因的表達降低[11]。lnc-Ang362是調節Ang Ⅱ的lncRNA，其水平的敲低影響了血管平滑肌細胞的增殖，提示其在Ang Ⅱ相關心血管疾病的診斷中的潛在作用[12]。lncRNA ANRIL，通過調節參與細胞增殖，細胞凋亡，細胞外基質重塑和炎癥反應的基因表達，在動脈粥樣硬化進展中發揮關鍵作用。而敲低lncRNA MALAT1表達水平，則提示體外增殖至遷移內皮細胞表型的平衡，其遺傳缺失或藥理學抑制可減少血管生長[13]。最新研究表明，lncRNA MALAT1可以激活p38/MAPK信號通路并調節糖尿病青光眼新生血管的生長?？傊?，lncRNA MALAT1作為基因表達調控因子的出現無疑會改變我們對病理性血管生成復雜調控網絡的認識。

糖尿病新生血管性青光眼是長期糖尿病患者最常見的血管并發癥之一。視力惡化、虹膜炎癥、視網膜血管新生、血管通透性增加、血管細胞凋亡與其病情進展密切相關。高血糖是糖尿病最重要的特征，在糖尿病血管并發癥發展過程中對血管細胞產生不良影響。MALAT1最初被鑒定為lncRNA，在非小細胞肺腫瘤轉移的高風險個體中顯示高表達，其表達在廣泛的腫瘤中顯著上調，如肺癌、肝癌、腎細胞癌、膀胱癌和骨肉瘤[14]。以前的研究表明，MALAT1在腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移中具有積極作用[15]。研究發現，在體外細胞實驗中，高血糖可導致視網膜內皮細胞和糖尿病虹膜細胞中lncMALAT1水平的顯著上調，而沉默lncMALAT1的表達則可顯著減輕糖尿病誘導的虹膜血管形成，血管滲漏和虹膜炎癥。此外，研究同時發現，體外MALAT1的基因消除抑制了內皮細胞的增殖，遷移和管形成能力，這是內皮細胞生物學的典型方面[16]。本研究結果顯示，病例組lncRNA MALAT1蛋白表達評分高于對照組；病例組lncRNA MALAT1蛋白表達陽性率明顯高于對照組；病例組lncRNA MALAT1 mRNA表達水平高于對照組，這與上述討論符合，提示lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中表達水平升高；結合上述討論，沉默lncRNA MALAT1表達有可能改善虹膜膜免于高血糖誘導的變性破壞，這將在后續研究中進一步探討。

最新研究發現高葡萄糖應激能激MAPK信號傳導途徑， MAPK活化具有一系列生理作用[17，18]，如細胞炎性、細胞凋亡，細胞增殖，有絲分裂、多種基因轉錄；異常MAPK活性可導致持續的細胞增殖或對外部刺激的輕微反應。高水平的lncRNA MALAT1可顯著改變磷酸化p38 MAPK的水平，進而磷酸化的ERK1/2或JNK1/2，激活MAPKs，導致其下游炎性因子過表達，本研究結果顯示，病例組IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于對照組，差異有統計學意義；lncRNA MALAT1 蛋白表達評分、lncRNA MALAT1 mRNA與IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α正相關關系明顯，差異有統計學意義。這與上述結論符合，同時也提示lncRNA MALAT1可誘導炎性反應加劇糖尿病新生血管性青光眼的病變程度。

綜上所述，lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中表達水平升高，其可誘導炎性反應加劇糖尿病新生血管性青光眼的病變程度。